Bu protokol, araştırmacıların sadece analiz boru hatlarını kolaylaştırmalarına izin vermekle kalmayacak, aynı zamanda organoid akışlarından daha fazla bilgi çıkarmalarına izin verecek ve böylece çeviri alaka düzeyini artıracaktır. Bu protokolün temel avantajı, kolaylaştırılmış bir iş akışını otomatik ve klinik olarak ilgili bir analiz boru hattı ile birleştirmesi ve böylece araştırmacıların tek bir organoid ekrandan zorlayıcı miktarda bilgi elde etmelerini sağlamasıdır. Bu teknik, bu ex vivo organoid ilaç taramalarından kanser hastaları için klinik tedavi yanıtını tahmin etmek için çok umut verici erken sonuçlarla kullanılabilir.
Amaç, yazılım çözüm platformunu agnostik hale getirmektir, böylece araştırmacılar kendilerine sunulan canlı hücre görüntüleme cihazını kullanabilirler. Hasta kaynaklı tümör organoidlerini veya PDTO'ları, hücre dışı matriste veya ECM'de, altı kuyucuklu mikroplakadaki kubbelerde enzimatik olarak ayrıştırarak başlayın. Bunun için önce ortamı aspire edin ve ECM kubbelerini PBS ile bir kez yıkayın.
Daha sonra, kuyuya iki mililitre ayrışma enzimi ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe etmeden önce kubbelerdeki organoidleri mekanik olarak ayırmak için bir mililitrelik bir pipet kullanarak içeriği 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Kuluçka sonrası, içeriği yukarı ve aşağı pipetleyin ve organoidlerin mikroskop kullanarak tek hücrelere uygun şekilde ayrışıp ayrılmadığını kontrol edin.
Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca tüpü 450 g'da ADF + Santrifüj ekleyerek hacmi 10 mililitreye kadar çıkarın ve bir Pasteur pipet ve emme pompası kullanarak süpernatantı aspire edin. Pelet, seçilen bir yöntem kullanarak hücre sayısını saymadan önce, peletin boyutuna bağlı olarak tam pankreatik duktal adenokarsinomun veya PDAC, organoid kültür ortamının 100 ila 200 mikrolitresinde resüde askıya alın. ECM kubbelerindeki tek hücreleri plakalamak için, gerekli miktarda çözülmüş ECM ekleyerek uygun miktarda hücre süspansiyonunu seyreltin.
Daha sonra, altı delikli bir plakada kuyu başına 10 adede kadar 20 mikrolitre damlacık damlacığı 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılır. Plakayı ters çevirin ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kuyucukları 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş tam ortamla kaplayın ve bir inkübatörde iki ila üç gün boyunca inkübe edin.
İki ila üç günlük organoidleri hasat etmek için, önce ortamı aspire edin ve organoidleri bir kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, ECM kubbelerinin sayısına bağlı olarak altı delikli plakanın bir kuyucuğuna, dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş bir ila iki mililitre organoid hasat çözeltisi ekleyin. Buz üzerinde tutulan plakayı, sallanan bir platformda 10 dakika boyunca inkübe edin.
Şimdi ECM kubbelerini, kuyucuklardaki içeriği bir mililitrelik pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın. Bir kez daha, ECM kubbelerinin mikroskop altında ayrışmasını görsel olarak onaylamadan önce organoidleri buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Organoidleri, PBS'de% 0.1 BSA ile önceden kaplanmış 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 g'da ADF + Santrifüj ekleyerek hacmi 10 mililitreye kadar oluşturun.
Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve boyutuna bağlı olarak peleti bir mililitreye kadar tam PDAC organoid ortamında istenen nihai organoid konsantrasyonuna kadar yeniden askıya alın. Pipetleme robotu kontrol uygulamasını açın, Protokoller'i seçin ve sağlanan Ek Dosya 6'yı belirtilen alana sürükleyip bırakmadan önce İçe Aktar'a tıklayın. İçe aktarılan protokolü seçin.
Güverte Kurulumu alanında gösterilen düzene göre, soğutma elemanları ve plastik eşyalar da dahil olmak üzere tüm laboratuvar gereçlerini güvertelere yerleştirin. 25 mililitrelik rezervuar ve soğutma elemanı için sol yuvayı kullanın. Ardından, Protokolü Çalıştır'a tıklayın ve Kuruluma Devam Edin.
Labware Kurulumu sekmesini açın, Labware Konum Denetimini Çalıştır'a tıklayın ve pipetleme robotunu yeni donanıma kalibre etmek için talimatları izleyin. Soğutma elemanının üzerine yerleştirilen 25 mililitrelik hazneyi soğutulmuş organoid tohumlama çözeltisiyle doldurun ve pipetleme robotunu harekete geçirmek için Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Daha sonra, mikro plakayı dört santigrat derecede bir dakika boyunca 100 g hızında santrifüj edin.
Dijital ilaç dağıtıcı kontrol yazılımını kullanarak ilaç dağıtım protokolünü oluşturmak için, imleci plaka düzeninin üzerindeki Plaka 1'in üzerine getirin. Plaka Özniteliklerini Düzenle'yi seçin ve plaka türünü 384 kuyu olarak, ek hacmi 50 mikrolitre olarak ve DMSO sınırını %1 olarak doldurun Sıvılar'ın yanındaki ekleme düğmesine tıklayarak sıvı ekleyin ve adlandırmak için yeni oluşturulan sıvıya çift tıklayın. Ardından, sınıfı DMSO bazlı veya sulu artı Ara 20 olarak seçin ve konsantrasyonu doldurun.
İlaç titrasyonunun plaka düzenini oluşturmak için Kuyular'ı seçin ve Titrasyon'a tıklayın. Sıvı için, istenen en yüksek konsantrasyon ve en düşük konsantrasyon ile birlikte ilgilenilen ilacı seçin. Çoğaltmalar için en az iki tane seçin ve istediğiniz titrasyon modelini seçin.
Pozitif kontrol için plaka düzenini oluşturmak için, üç kuyucuk seçin, Değeri Ayarla'ya tıklayın ve maksimum hücre ölümünü indüklemek için DMSO'daki 10 milimolar stoktan iki mikromolar staurosporini doldurun. Sitotoks Yeşili için, kullanılan tüm kuyucukları seçin, Değer Ayarla'ya tıklayın ve kuyu başına 60 nanomolar değeri girin. Negatif kontrol ve DMSO normalizasyonu için, araç kontrolü için ek dört kuyu bulunan tüm kuyuları seçin.
Şimdi sağ tıklayın ve normalleştirilmiş sıvı sınıfını DMSO tabanlı olarak atamadan önce Normalleştirme'yi seçin. Ardından, her kuyucukta eşit bir DMSO konsantrasyonu elde etmek için en yüksek sınıf hacmine normalleştirin. Ardından, sol üst köşedeki Çalıştır altındaki oka tıklayın ve Her Zaman Simüle Et'i seçin, ardından herhangi bir hatayı tanımlamak ve hazırlanacak her ilacın hacimlerini elde etmek için Simüle Et'e tıklayın.
Şimdi ilaç dağıtım protokolünü başlatmak için Çalıştır'a tıklamadan önce Çalıştır düğmesinin altındaki Her Zaman Simüle Et seçeneğinin işaretini kaldırın ve talimatları izleyin. Buharlaşmayı önlemek için sızdırmazlık membranını mikro plakaya uygulayın. Canlı hücre görüntüleyici denetim yazılımını açın ve örnek yöntem XML dosyasını içe aktarmak için Dosya'ya gitmeden önce Yöntem Düzenleyicisi Yeni'yi seçin.
Alternatif olarak, yeni bir dosya oluşturmak için makaledeki talimatları izleyin. Ardından, verileri birleştirmek ve sıkıştırmak T0.To taramayı başlatmak için Başlat'a tıklayın, canlı hücre görüntüleyici kontrol yazılımı tarafından her zaman noktasında her bir tarama için oluşturulan tüm bireysel deneme klasörlerini aktarmak için yeni bir ana klasör oluşturun ve makalede verilen talimatları izleyerek ilgili klasörleri adlandırın. İlaç dağıtım protokolünden plaka haritası düzenine sağ tıklayarak ve verileri bir XLSX dosyasına yapıştırmak için tüm kuyucukları kopyalayarak dijital ilaç dağıtıcı kontrol yazılımında bir XLSX plaka haritası hazırlayın.
Sitotoks Yeşili ve staurosporin verilerini çıkarın, hücre hattı için bir matris ekleyin ve negatif kontrol ve pozitif kontrol girin. Veri Sıkıştırma Aracı'nı açın. Ara'ya tıklayın, üst klasörü seçin ve görüntü verilerini sıkıştırmayı başlatmak için Sıkıştır'a tıklayın.
Tüm TIFF görüntü dosyaları, ebeveyn klasöründeki yeni veri kümeleri klasöründeki her kuyucuk için tek bir HDF5'e sıkıştırılır. Görüntüleri analiz etmek için görüntü analizi web uygulaması platformuna gidin, oturum açın ve Giriş sekmesinde Yeni Proje Ekle'ye tıklayın. Proje adını girin, Devam'a basın ve HDF5 dosyalarını içeren veri kümeleri klasörünü karşıya yüklemeden önce Yeni Deneme Ekle'yi seçin.
Yükledikten sonra, ek işlevler için Plaka Haritası Yükle'ye tıklamak üzere proje ve deneme klasörüne gidin. Ardından, sırayla Analizi Çalıştır'a tıklayın, görüntü analizini başlatmak için Multi-Organoid Analizi, Varsayılan Parametreler ve son olarak Analiz Et'i seçin. Daha fazla veri işleme için analizin doğruluğunu onaylamadan önce her bir kuyucuğun ölçümlerini ve bölümlere ayrılmış görüntüleri veya videoları içeren ham veri tablolarını indirmek için Sonuçları İndir'e tıklayın.
Organoid tohumlama yoğunluğu ve boyutundaki değişimleri hesaba katmak için, azaltılmış hata çubuklarında belirtildiği gibi, çoğaltmalar arasındaki varyasyonları azaltmak için büyüme hızına dayalı metrikler kullanılmıştır. Negatif kontrol, pozitif kontrol ve kombine gemsitabin ve paklitaksel ile tedavi edilen PDTO için görüntüler, tedavinin ağırlıklı olarak, normalleştirilmiş ilaç yanıtı veya NDR ile karşılık gelen sınırlı miktarda hücre ölümü ile büyüme durmasına neden olduğunu göstermiştir. sıfırın hemen altındaki değer. PDAC_052 ve PDAC_087 olmak üzere iki ek çizgi kullanıldıktan sonra, GR metriklerinin kullanımını destekleyen üç çizgi arasındaki büyüme hızında net bir fark gözlendi.
NDR doz-yanıt eğrileri, GR eğrilerine kıyasla üç farklı hasta arasında artan bir dinamik aralık ve ayrım ile sonuçlandı. Zaman içinde NDR'nin belirlenmesi, PDAC_052 ve PDAC_060 düşük dozda gemsitabin-paklitaksel ile çok benzer bir sitostatik ilaç yanıtına sahip olduğunu, buna karşılık gelen orta ve yüksek dozlar için açık bir diferansiyel sitostatik ve sitotoksik yanıt gözlenebileceğini göstermiştir. Bu ilaç yanıtları hastalarda gözlenen klinik yanıtlarla tutarlıydı.
Klonal dinamikler, PDAC_087 tedaviden sonra en dirençli alt klonlara sahip olduğunu ortaya koydu; bu, ilginç bir şekilde, pozitif kontrol staurosporinine en az duyarlı olan hastada gözlenen hastalığın agresif doğası ile tutarlıdır. Protokolün en önemli yönü, EKM'yi içeren tüm çözeltileri tohumlama sırasında soğutulmuş halde tutmaktır, çünkü ECM'nin yanlış katılaşması aşağı akış görüntü analizine müdahale edebilir. Islak laboratuvar çalışmasının otomasyonu, görüntü analizi ve aşağı akış veri işleme, araştırmayı hızlandırmak ve yeni kombinasyon terapilerini daha kolay tanımlamak için yardımcı olabilir.
