Bu protokol, örneğin böcek direnci ve sıtma paraziti gelişimi de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik yollarda yer alan sivrisinek genlerinin rolünün karakterizeini desteklemektedir. Yöntem, transgene yerleştirmeyi önceden karakterize edilmiş tek genomik konumlara yönlendirir ve bu nedenle konumsal etki sorununu etkili bir şekilde önleyen alternatif transgenlerden kaynaklanan fenotipleri doğrudan karşılaştırmaya izin verir. Bu yöntem, halk sağlığı ve tarımsal öneme sahip çeşitli böcek türlerine uygulanabilir ve uygulamaları bakterilerden memeli hücrelerine kadar geniş bir şekilde uzanır.
Baskın floresan işaretleyiciyi, attB rekombinasyon alanlarını ve istenen transgene kargoyu taşıyan attB donör plazmidleri tasarlayarak başlayın. Transgenik kaseti taşıyan tüm plazmid veya kaset değişimi için iki ters attB sitesinin entegrasyonu için tek bir attB sitesi kullanın. Endotoksin içermeyen bir saflaştırma kiti kullanarak donör ve yardımcı plazmidleri saflaştırın.
İlgi transgene taşıyan attB etiketli donör plazmid ve integrase taşıyan yardımcı plazmid donör plazmid mikroliter başına 350 nanogram ve yardımcı plazmid mikroliter başına 150 nanogram nihai konsantrasyonda bir karışım elde etmek için birleştirin. Üç azı dişi sodyum asetatın 0.1 hacmini ve 2.5 hacim buz soğuğu% 100 etanol, sonra girdap ekleyerek DNA'yı çökelt. Beyaz bir çökeltme hemen görülebilir olmalıdır.
Peleti yıkayın ve enjeksiyon tamponunda yeniden araklayıp mikroliter başına toplam 500 nanogramlık son konsantrasyona ulaşın. Daha sonra her biri 10-15 mikrolitrelik aliquots hazırlayın ve negatif 20 santigrat derecede saklayın. Kan, mikro enjeksiyondan 72 saat önce istenen yanaşma hattından dört ila yedi günlük sivrisinekleri ve vahşi tip meslektaşlarını besler.
Embriyonun arka kutbu 45 derecelik bir açıyla hedeflenerek 25 milimolar sodyum klorürde Anopheles gambiae embriyo mikro enjeksiyonları gerçekleştirin. Arka kutbu 30 derecelik bir açıyla hedef alarak halokarbon yağından Anopheles stephensi embriyo mikro enjeksiyonları gerçekleştirin. Enjeksiyondan hemen sonra, yumurtaları steril damıtılmış su ile dolu bir Petri kabına aktarın ve böcek koşullarına geri döndürün.
Kuluçkadan çıktıktan sonra, G0 larvalarını günlük tuzlu damıtılmış su içeren bir tepsiye aktarın ve pupalara geri koyun. Stereoskop altında G0 pupalarını cinsiyete göre sıralayın. Erkeklerin üç ila beş kişilik gruplar halinde ayrı kafeslerde ortaya çıkmasına izin verin ve yaşla eşleşen vahşi tip dişilerin on kat fazlalığını ekleyin.
Dişilerin 10 ila 15 kişilik gruplar halinde ayrı kafeslerde ortaya çıkmasına izin verin ve eşit sayıda yaşla eşleşen vahşi tip erkekler ekleyin. Yetişkinlerin dört ila beş gün çiftleşmelerine izin verin ve kadınlara bir kan unu sağlayın. Yumurtaları ve ortaya çıkan yeni nesil G1'leri toplayın.
G1, L3 ve L4 larvalarını ıslak filtre kağıdıyla kaplı bir Petri kabında veya mikroskop kaydırağı üzerinde toplayın ve attB etiketli kargo ile tanıtılan işaretleyicinin varlığı için floresan bir stereoskop kullanarak tarayın. Tek attB tasarımları için, yeni ve önceden var olan işaretleyicinin varlığını tarayın. Kaset değişimi için çift attB tasarımları için, yeni işaretleyicinin varlığını ve önceden var olanın kaybını tarayın.
Dönüştürülmüş G1 pupalarını cinsiyete göre sıralayın ve karşı cins yaşla eşleşen vahşi tip bireylerle toplu olarak geçin. Yetişkinlerin dört ila beş gün çiftleşmelerine ve bir kan unu sağlamalarına izin verin. Tek entegrasyon deneyleri için yumurtaları doğrudan toplu haçtan toplayın.
Kaset değişim deneyleri için, tek dişilerden yumurta toplayın ve iki alternatif kaset yönünün potansiyel varlığı nedeniyle moleküler değerlendirme tamamlanana kadar soyu ayrı tutun. Floresan işaretleyicinin varlığı için G2 soyunun taranır ve moleküler analiz için G2 pozitif bireylerin bir alt kümesini ayırın. Gerisini yetişkinliğe gerile.
Metin taslağında açıklandığı gibi PCR ile ekleme sitelerinin moleküler doğrulamasını gerçekleştirin. Tek bir entegrasyon için, öngörülen ekleme bölgesinin orijinal yerleştirme yapısını ve iki hibrit site attL ve attR arasındaki donör plazmid dizisini taşıdığından emin olun. Kaset değişimi için, tahmin edilen ekleme sitesinin, karma ters çevrilmiş attL sitelerinin özgün ters attP sitelerinin ve değişim şablonunun aralarında bulunan kasetin yerini aldığı yerleştirme satırıyla aynı olduğundan emin olun.
Protokol yaklaşık 10 hafta içinde kararlı bir Anopheles transgenik hattı oluşturmak için kullanıldı. Dönüşümün fenotipik doğrulaması, 3xP3 promotörü tarafından düzenlenen floresan belirteçlerin taranarak gerçekleştirildi. Yeni bir Anopheles stephensi hattı, DS kırmızı işaretli bir kasetin CFP ile işaretlenmiş bir yerleştirme hattına yerleştirilmesiyle elde edildi ve bu da G1 soyunun gözlerdeki kırmızı ve mavi floresan ile belirtildiği gibi her iki işareti de ifade ettiği sonucuna vardı.
Kaset değişim tasarımları, başlangıçta yerleştirme hattına yerleştirilen işaretleyicinin donör plazmid ile değiştirilmesiyle sonuçlanır. Bu işaret değişimi, CFP işaretleyicisinin kaybolduğu ve YFP işaretleyicisinin sarı göz ve sinir kordonu floresan ile sonuçlandığı anopheles gambiae yerleştirme hattında gösterilmiştir. Bazen, RMCE, bir larvanın hem orijinal CFP hem de yeni YFP işaretleyicileri ile işaretlendiği istenen transgenik kasetin değişimi yerine tek bir entegrasyon olayına neden olabilir.
Bir floresan işaretleyicinin varlığını tadırken, sinyalini olası arka plan otomatik floresanlarından ayırt etmek çok önemlidir. Büyütmeyi artırmak ve floresanın organizatör tarafından yönlendirilmesi beklenen doku ve organlara odaklanmak, gerçek CFP pozitif bireyleri tanımlamak için gereklidir. Bireysel transformantlar da beklenen ekleme alanını doğrulamak için PCR üzerinden moleküler olarak değerlendirildi.
Bir değişim Anopheles gambiae hattından bireylerde PCR doğrulaması burada gösterilmiştir. Uygun mikro enjeksiyon tekniği bile, donör ve yardımcı plazmidlerin doğru tasarımı ve hazırlanması ve uygun sivrisinek hayvancılık şemasını takip etmek transgenik bireyler elde etmek için anahtardır. Bu prosedür, örneğin GAL4/UAS sistemi gibi gen aşırı ekspresyon veya susturmaya neden olan elementlerin yanı sıra sivrisinek genetik kontrolü için gen tahrik elemanları ve anti-patojen molekülleri eklemek için kullanılabilir.
