Bipartit GAL4-UAS sistemi, Anopheles gambiae'de gen ekspresyonunun mekanotemporal kontrollü bir şekilde genetik modifikasyonu yoluyla fonksiyonel genetik analiz için çok yönlü bir araçtır. İkili sistem, ciddi fitness maliyetleri indüklseniz bile transgene ekspresyonunun fenotipik karakterizasyonu için deneysel yaklaşımlarda esneklik sağlar. Bu sistem, insektisit direnci, patojen iletimi veya genetik kontrol yöntemlerinde kullanımı olan genlerin fenotipik karakterizasyonu için kullanılabilir.
Bir araştırma teknisyeni olan Fraser Coleman, bu prosedürün sergilenerek sergilenecekTir Bu prosedür Başlangıç pupaları üç mililitre plastik Pasteur pipet kullanarak toplayarak, ucu stereo mikroskopla kullanıma uygun net bir düz tabağa kesilmiştir. Pupaların etrafındaki suyun çoğunu dikkatlice çıkarın. Floresan ampulü açın ve ısınmasına izin verin.
Floresan işaretleyiciyi takarken beklenen farklı fenotiplerin bir ifadesinin renk mekanomporal desenlerini ve oranını göz önünde bulundurun. Floresan stereoskopta gerekli filtreyi seçin ve sahne plakasının ortasına yönlendirilmiş renkli bir ışık demeti olup olmadığını kontrol edin. Beyaz ışık altında, pupaları görüş alanında ortalayın ve odak noktasına getirin.
Beyaz ışığı kapatın ve görünür bir floresan deseni ile ilgi fenotipini taşıyan pupa alanını odak noktasına getirmek için ince odağı kullanın. Pupaları hafifçe çevirmek ve anal kürekleri hareket ettirmek için ince bir detaylandırma fırçası kullanın, böylece dış cinsel organ tanımlanabilir. Ayırt edici dış cinsel organa dayalı ayrı pupalar.
Erkekler, anal küreklerin uzunluğunun yaklaşık yarısı kadar olan son sırt segmentinden ekstrüze olan uzun bir tüpe sahiptir. Dişi pupaların dış cinsel organı oldukça kısa ve bifurcatedir. Cinsiyetli pupaları su ile berrak 20 mililitrelik tüplerde 10 veya daha az gruplara ayırın ve tüpleri bir pamuk yünü topu ile kapatın.
İstenilen sayıda erkek ve dişi yetişkini tüplerden bir kafese veya küçük bir kovaya apire edin, bu transfer sırasında yetişkinlere zarar vermemeye dikkat edin. Kan beslemeden önce haçı beş ila yedi gün boyunca koruyun. Ertesi gün, embriyo gelişimini incelemek için yumurta toplanabilir.
Yumurtlama odasını birleştirin ve içine 10 ila 15 kanla beslenen dişiyi dikkatlice tanıtın. Yumurtlama odasını örtün ve 20 dakika bekletin. Sivrisinekleri serbest bırakmamaya dikkat ederek 50 mililitrelik polipropilen tüpünü yumurtlama kabından dikkatlice ayırın.
Tencereyi örtün ve yumurtaların ilginin gelişim aşamasına olgunlaşmasına izin verin. Yumurtaları ince bir boya fırçası kullanarak tencereden alın ve 40 milimetrelik kazılmış bir cam blokta suya yerleştirin. Suyu bir mikropipette ile cam bloktan dikkatlice çıkarın ve yumurtaları 500 mikrolitre FAA'da örtün.
30 dakika boyunca oda sıcaklığında orbital çalkalayıcı üzerinde hafifçe salın. FAA çözeltisinin tüm izlerini gidermek için yumurtaları damıtılmış suyla 15 kez iyice durulayın. 1000 mikrolitrelik bir mikropipette kullanarak ekleyin ve ardından yumurtalara zarar vermemeye dikkat ederek bir seferde bir mililitre damıtılmış suyu çıkarın.
Sabit yumurtaları bir mililitre Trpis çözeltisi ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Yumurtalar, beş dakikalık kuluçkadan sonra soluk yamalar geliştirmeye başlayacak ve sonunda temizlendikten sonra süt beyazı bir renge ulaşacaktır. Trpis çözeltisinin tüm izlerini gidermek için yumurtaları damıtılmış suyla 15 kez iyice durulayın.
3xP3 promotörü tarafından yönlendirilen floresan belirteçlerin ekspresyumu, Anopheles gambiae pupalarının gözlerinde ve ventral gangliyonlarında görülür. Farklı renkli floresan belirteçler kullanmak, farklı GAL4 ve UAS bileşenleri taşıyan değiştirilmiş kişilerin seçilmesine ve taranmalarına izin veriyor. İki partili GAL4-UAS sistemi ile çalışırken, hem GAL4 hem de UAS bileşenlerini taşıyan soy elde etmek için farklı suşlardan erkek ve dişileri geçmek gerekir.
Pupaların erkek ve kadın dış genital organında gözlenen diferansiyel morfoloji seks için kullanılır. Tanımlanamayan bir pupa örneği burada vurgulanmıştır. Sağda gösterildiği gibi, tüm suyun pupalardan uzaklaştırılması, anal kürekler cinsel organın görselleştirilmesini belirsiz hale geldiği için seks zorlaşmasını arttırır.
Bipartit GAL4-UAS sistemi gen ekspresyonunun kontrollü bir mekansal şekilde değiştirilmesine izin eder. Bu, UAS-mCherry yanıtlayıcı hattı ile oenosit ve her yerde bulunan GAL4 dört eksprese sürücü hattını geçerek görselleştirilebilir. Bipartit GAL4-UAS sistemi kullanmanın önemli bir yararı, embriyonik aşamada bile ölümcül fenotipleri inceleme kolaylığıdır.
Bunu yapmak için embriyoların iç morfolojisini görselleştirmek gerekir. Embriyo temizleme protokolünün tamamlanmasının ardından 12, 24 ve 36 saat sonra embriyonik gelişimin farklı evrelerinde gözlenen normal morfolojik özellikler görülebilir. Pupaların ve yumurtaların bozulmasına izin verilmemesi bu prosedür boyunca hayati önem taşır.
Bu nedenle, sıvıları çıkarırken hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. GAL4-UAS yöntemi, insektisit direncinde yer alan genleri ve gen tahrik kontrol yöntemlerinde potansiyel kullanımları olanları işlevsel olarak karakterize etmemizi sağlamıştır.
