Questo protocollo supporta la caratterizzazione del ruolo dei geni delle zanzare coinvolti in una varietà di percorsi fisiologici, tra cui, ad esempio, la resistenza agli insetti e lo sviluppo di parassiti della malaria. Il metodo guida l'inserimento transgenico in singole posizioni genomiche pre-caratterizzate e quindi consente di confrontare direttamente i fenotipi risultanti da transgeni alternativi evitando efficacemente il problema dell'effetto posizionale. Questo metodo può essere applicato a una varietà di specie di insetti di salute pubblica e importanza agricola e le sue applicazioni si estendono ampiamente dai batteri alle cellule di mammifero.
Inizia progettando plasmidi donatori attB che trasportano il marcatore fluorescente dominante, i siti di ricombinazione attB e il carico transgenico desiderato. Utilizzare un singolo sito attB per l'integrazione dell'intero plasmide che trasporta la cassetta transgenica o due siti attB invertiti per lo scambio di cassette. Purificare i plasmidi donatori e aiutanti utilizzando un kit di purificazione privo di endotossine.
Combinare il plasmide donatore con tag attB che trasporta il transgene di interesse e il plasmide helper che trasporta l'integrasi per ottenere una miscela con una concentrazione finale di 350 nanogrammi per microlitro del plasmide donatore e 150 nanogrammi per microlitro del plasmide helper. Precipitare il DNA aggiungendo 0,1 volumi di tre molari di acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo ghiacciato al 100%, quindi vortice. Un precipitato bianco dovrebbe essere immediatamente visibile.
Lavare il pellet e risospesarlo nel tampone di iniezione per raggiungere una concentrazione finale totale di 500 nanogrammi per microlitro. Quindi preparare aliquote di 10-15 microlitri ciascuna e conservarle a 20 gradi Celsius negativi. Il sangue alimenta le zanzare da quattro a sette giorni dalla linea di attracco desiderata e le loro controparti selvatiche 72 ore prima della microiniezione.
Eseguire microiniezioni embrionali di Anopheles gambiae in cloruro di sodio 25 millimolari prendendo di mira il polo posteriore dell'embrione con un angolo di 45 gradi. Eseguire microiniezioni embrionali di Anopheles stephensi in olio di alocarbonio prendendo di mira il polo posteriore con un angolo di 30 gradi. Immediatamente dopo l'iniezione, trasferire le uova in una capsula di Petri piena di acqua distillata sterile e riportarle in condizioni insetticide.
Alla schiusa, trasferire la larva G0 in un vassoio con acqua distillata salata ogni giorno e retro alle pupe. Ordina le pupe G0 per sesso sotto uno stereoscopio. Lascia che i maschi emergano in gabbie separate in gruppi da tre a cinque e aggiungi un eccesso di dieci volte di femmine selvatiche di tipo selvatico abbinate all'età.
Consenti alle femmine di emergere in gabbie separate in gruppi da 10 a 15 e aggiungi un numero uguale di maschi selvatici di tipo abbinato all'età. Consentire agli adulti di accoppiarsi per quattro o cinque giorni e fornire alle femmine un pasto di sangue. Raccogli le uova e alleva i G1 emergenti di prossima generazione.
Raccogli le larve G1, L3 e L4 in una capsula di Petri rivestita con carta da filtro bagnata o su un vetrino per microscopio e schermale usando uno stereoscopio fluorescente per la presenza del marcatore introdotto con il carico etichettato attB. Per i singoli disegni attB, schermo per la presenza del marcatore nuovo e preesistente. Per i progetti a doppio attB per lo scambio di cassette, schermo per la presenza del nuovo marcatore e la perdita di quello preesistente.
Ordina le pupe G1 per sesso e incrociale in massa con individui di tipo selvatico di sesso opposto abbinati all'età. Consentire agli adulti di accoppiarsi per quattro o cinque giorni e fornire un pasto di sangue. Per esperimenti di integrazione singola, raccogliere le uova direttamente dalla croce in massa.
Per gli esperimenti di scambio di cassette, raccogliere le uova da singole femmine e mantenere la progenie separata fino al completamento della valutazione molecolare a causa della potenziale presenza di due orientamenti alternativi della cassetta. Esaminare la progenie G2 per la presenza del marcatore fluorescente e mettere da parte un sottoinsieme di individui G2 positivi per l'analisi molecolare. Allevare il resto fino all'età adulta.
Eseguire la validazione molecolare dei siti di inserimento con PCR come descritto nel manoscritto di testo. Per una singola integrazione, assicurarsi che il sito di inserimento previsto porti il costrutto di attracco originale, oltre all'intera sequenza del plasmide donatore tra i due siti ibridi attL e attR. Per lo scambio di cassette, assicurarsi che il sito di inserimento previsto sia identico a quello della linea di aggancio in cui i siti attL ibridi invertiti sostituiscono i siti attP invertiti originali e il modello di scambio sostituisce la cassetta originariamente presente tra di loro.
Il protocollo è stato utilizzato per generare una linea transgenica stabile di Anopheles in circa 10 settimane. La validazione fenotipica della trasformazione è stata eseguita mediante screening per i marcatori fluorescenti regolati dal promotore 3xP3 sono mostrati qui. Una nuova linea Anopheles stephensi è stata ottenuta inserendo una cassetta marcata in rosso DS in una linea di aggancio contrassegnata con CFP che ha portato la progenie G1 ad esprimere entrambi i marcatori come indicato dalla fluorescenza rossa e blu negli occhi.
I progetti di scambio di cassette comportano la sostituzione del marcatore originariamente inserito nella linea di aggancio con quello del plasmide donatore. Questo scambio di marcatori è stato dimostrato in una linea di aggancio di Anopheles gambiae in cui il marcatore CFP è stato perso e il marcatore YFP acquisito con conseguente fluorescenza dell'occhio giallo e del cordone nervoso. Occasionalmente, RMCE può provocare un singolo evento di integrazione invece dello scambio della cassetta transgenica desiderata in cui una larva viene contrassegnata sia con la CFP originale che con i nuovi marcatori YFP.
Quando si esegue lo screening per la presenza di un marcatore fluorescente, è fondamentale distinguere il suo segnale da una possibile autofluorescenza di fondo. Aumentare l'ingrandimento e concentrarsi sui tessuti e sugli organi in cui ci si aspetta che la fluorescenza sia guidata dal promotore è necessario per identificare veri individui positivi alla CFP. I singoli trasformatori sono stati anche valutati molecolarmente tramite PCR per confermare il sito di inserimento atteso.
La convalida PCR in individui da una linea di scambio Anopheles gambiae è mostrata qui. Anche un'appropriata tecnica di microiniezione, la progettazione e la preparazione accurate dei plasmidi donatori e aiutanti, nonché il seguire lo schema di allevamento delle zanzare appropriato sono fondamentali per ottenere individui transgenici. Questa procedura può essere utilizzata per inserire elementi che causano sovraespressione genica o silenziamento, ad esempio il sistema GAL4 / UAS, nonché elementi di gene drive e molecole anti-patogeno per il controllo genetico delle zanzare.
