Bu protokol önemlidir, çünkü yaygın genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak tarihsel olarak dönüştürülmesi zor olan anopheles gambiae için belirli bir mikroenjeksiyon yöntemi sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, transgenik Anopheles gambiae'yi güvenilir bir şekilde oluşturmasıdır. Bu tekniğin uygulamaları, popülasyon bastırmaya veya vahşi tip Anopheles gambiae popülasyonlarının değiştirilmesine uygun sivrisineklerin oluşturulmasını kolaylaştırarak sıtma eliminasyonu için yeni stratejilere doğru uzanmaktadır.
Bu metodoloji farklı sivrisinek türlerine kolayca uyarlanabilir. Mikroenjeksiyon teknolojimiz sabır ve pratik gerektirir. Bir öğrenme eğrisi var.
Başlamak için, şeffaf 50 mililitrelik konik bir tüpe 20 ila 30 dişi yerleştirmek için bir aspiratör kullanın. Tüpün her iki ucundan da kesildiğinden ve bir ucunda lateks diş filmi, diğer ucunda ise sivrisineklerin yumurtalarını bırakacakları naylon ağ ve filtre kağıdı ile kaplı olduğundan emin olun. Sivrisinek dolu tüpü çift damıtılmış suyla dolu küçük bir Petri kabına yerleştirin, ardından tüpü ve kabı 45 dakika boyunca 28 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.
Tüpü inkübatörden çıkarın ve tüpü boş bir kafese yerleştirin. Sivrisineklerin uçmasına izin vermek için tüpe hafifçe dokunun. Tüm sivrisinekler uçtuktan sonra tüpü kafesten çıkarın.
Tüp sivrisineklerden arındırıldığında, alt halkayı sökün, naylonu çıkarın ve filtre kağıdını yumurtalarla birlikte tüpten dikkatlice çıkarmak için tokmaklar kullanın. Yumurta yüklü filtre kağıdını suyla nemlendirilmiş bir filtre kağıdı tabakası içeren plastik bir Petri kabına yerleştirin. Temiz bir cam kaydırağa bir zar koyun ve membranı bir filtre kağıdı parçasıyla örtmek için temiz önps kullanın ve membran filtresinin yaklaşık bir milimetresini açık bırakın.
Filtre kağıdını deiyonize suyla ıslatın, ardından fırçayı kullanarak 30 ila 50 embriyoyu zarın kenarına hafifçe aktarın ve yumurtaları zar boyunca dikey olarak hizalayın. Yumurtaları aynı yöne yönlendirin, böylece yumurtalar mikroenjeksiyon mikroskobu altında gözlendiğinde, arka uç aşağı konumdadır ve iğne ile 15 derecelik bir açı oluşturur. Zarın tüm kenarını yumurtalarla hizala.
İğneleri iki mikrolitre DNA karışımı ile doldurmak için bir mikro doldurucu ucu kullanın. İğneyi iğne tutucuya yerleştirin ve otomatik basınç pompası borularını bağlayın. İğneyi, slaytın düzlemi ile 15 derecelik bir açı olacak şekilde hizalayın.
İlk yumurtaya dikkatlice dokunarak iğne ucunu açın, ardından iğnenin ucunu arka direğe yaklaşık 10 mikrometreye yerleştirin. Başarılı bir enjeksiyon, yumurta içindeki sitoplazmın küçük bir hareketine yol açacaktır. Enjeksiyona devam etmek için bir sonraki yumurtaya geçmek için mikroskop koaksiyel sahne kontrollerini kullanın.
İğne ucunun açık kalmasını ve tıkanmamasını sağlamak için, başka bir embriyoya girmeden önce Enjekte et düğmesine basın ve iğnenin açılışındaki küçük damlacığı görselleştirin. İğne tıkanırsa, iğneyi temizlemek ve damlacık görselleştirme testini tekrarlamak için Temizle düğmesine basın. Damlacık boyutunun küçük kalmasını sağlamak için iğne ucu açıklığı biraz daha büyürse basıncı gerektiği gibi ayarlayın.
Bir iğne ile yaklaşık 40 ila 50 yumurta enjekte edin. Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, yumurtaları filtre kağıdı ile kaplı ve 50 mililitre deiyonize su ile doldurulmuş bir cam kaba durulayın. Bu protokol kullanılarak, Anopheles gambiae'nin G3 laboratuvar suşunun mikrop hattına otonom gen tahrikli bir sistem yerleştirildi.
Sistem, bu türdeki üçüncü kromozom üzerinde kardinal ortolog veya Agcd'yi hedeflemek için tasarlanmıştır. Plazmid pCO37 gösterilir. Nanos gen ortologunun düzenleyici unsurlarının kontrolü altında Streptococcus pyogenes Cas9 endonuclease içerir.
Ek olarak, bir U6 gen promotörü ve siyan floresan proteini ifade eden 3XP3 CFP baskın marker kasetinin kontrolü altında bir rehber RNA'ya sahiptir. Moleküler yaklaşımlar, AgNosCd-1 olarak belirlenen yaklaşık 10 kilo baz DNA çiftinin doğru yerleştirilmesini doğruladı. Kapsamlı takip analizleri, AgNosCd-1'in tahrikte yüksek verimli olduğunu, az sayıda dirençli alel yarattığını ve gen tahrik sisteminin entegrasyonu ve ekspresyoyunu nedeniyle büyük bir genetik yükü olmadığını göstermiştir.
Sivrisinek içeren homozigot gen güdüsü, larvalar, pupalar ve yeni ortaya çıkan yetişkinlerin kırmızı göz fenotipine sahip fonksiyon kaybı mutantlarıydı. Bu protokolü denerken, 88'de tutmak, açık gri yumurtalara iyi bir kuluçka için çok önemlidir ve beyaz yumurtalardan kaçının.
