Bu çalışma NIH Hibe 068.625, NSF Bağış 1063188 ve 0822613. Özel teşekkür tavşan gözlerinde hediye için İleri Bilim ve Teknoloji Beckman Enstitüsü&#39;nün Dr Marina Marjanovic gitmek Yaşayan Hücrelerinin Fizik Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Etik Açıklama: tavşanlardan Kornea dokusu Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı kılavuzların Üniversitesi doğrultusunda toplanmıştır. 1. TIRFM Kur NOT: lazer güvenlik gözlük Tüm zaman giyin. <ol><li> Malzeme Listesi&#39;nde yer gerekli tüm optik bileşenleri mevcuttur ve uyum için hazır olduğundan emin olun. Gerekirse, diğer şirketlerden eşdeğer fonksiyonları ile değiştirmeleri kullanın. Aynalar ve lensler kullanımı lazer eşleşen anti yansıtıcı (AR) kaplamalar olmalıdır emin olun. </li><li> Mikroskop arka bağlantı noktası merkezinin yüksekliği tüm optik bileşenlerin yükseklikleri ayarlayın. </li><li> Lazer, lazer çekim ve ND filtre (ler) monte edin. Görünür ışın tutarken mümkün olduğunca düşük lazer gücü aşağı zayıflatmak ND filtreleri kullanın. Uygun altıgen tuşları ile vidalarını sıkın. </li><li> Bir ışın yolu planlamak ve optik masaya bant veya işaretleyici (nokta ile işaretleyinŞekil 1&#39;de ted mavi çizgiler). Kolaylık olması açısından, optik masaya delik hattı boyunca düz bir koridor tutun. </li><li> Yer ayna M1 ilk dik açı fırsatta (Şekil 1). Planlanan ışın yolunun ikinci düz bir bölüm boyunca iki süsen yerleştirin. Konumunu ve lazer süsen geçer şekilde M1 eğimini hem ayarlayın. </li><li> Yer ayna M2 ikinci dik açı fırsatta (Şekil 1). Yolun üçüncü düz kesit boyunca 10X ışın genişletici (L1 ve L2, Şekil 1) yerleştirin. Işın genişletici optik masa ve planlanan ışın yolu hem de paralel olduğunu eğme gibi ayarlayın. <ol><li> Lazer, ışın her iki lenslerin merkezleri ile düz bir şekilde gider M1 ve M2 yinelemeli gibi ayarlayın. Genişletilmiş ışın demeti profili Gauss olmayan kırkılmış kadar bu adımı tekrarlayın. </li></ol></li><li> (L1 ışınını ortalamak için Fi M1 ayarlayınsaat&#39;in 1) ve M2 yinelemeli L2 kiriş (Şekil 1) merkezi. Kötü bir ışın profili, genellikle lazer kesilmiş olduğu anlamına gelir; Göz ile ışın profilini kontrol etmek için ışın genişletici sonra ışın engellemek için beyaz bir parça kağıt kullanın. Yüksek hassasiyetli analizi için, optik bir ışın profilcisini kullanmak. </li><li> Işın collimated öyle ki L1 ve L2 arasındaki mesafeyi ayarlayın. Tekrarlayın Adım 1.8 ve 1.9 gerekirse. NOT: kiriş boyutu mesafe ile değişmez zaman, kiriş bir TIRFM kurulum için yeterli collimated. Ayrıca ışın kolimasyon artırmak için, bu tür bir makaslama interferometre gibi araçlar kullanılabilir. Genişlemesinden sonra tipik bir kiriş boyutu ~ 20 mm&#39;dir. </li><li> Shutter, lazer. Mikroskop objektif sökün ve bir floresan hizalama hedef vida. Yer M3 ve M4 (Şekil 1) mikroskop portuna ve taret içindeki renkli aynadan üzerine genişletilmiş ışını doğrudan yansıtır. Lazer ışını t sıçrar emin oluno dikroik ve tavana doğru. </li><li> Floresan hedef ışınının parlak bölümünü ortalamak için M3 ayarlayın ve M4 ışın eğim dikey olarak ayarlamak için. </li><li> Shutter, lazer ve geri hedefini vida. Önceki adımda hizalama yapılırsa iyi hedefini çıkan simetrik bir nokta olmalıdır. İnce ayar M3 ve M4 eğilmeler amacı dışında lazer gücü ve ışın profili optimize etmek. </li><li> Mikroskop bir EMCCD kamera monte ve bir bilgisayara kamera bağlamak. Kamera için yazılımını başlatın. </li><li> Mikroskop floresan örnek (Flüoroforlann çözelti) monte edin. Kameradaki parlak floresan noktada bak. Odak değiştiğinde nokta ekranda kaymamasını kontrol edin. </li><li> L3 odak uzunluğu (~ 30 cm) eşittir hedefi arka odak düzlemi bir mesafede XYZ çeviri sahnede TIR lens (L3, Şekil 1) yerleştirin. L3 pozisyonunu ayarlayınve lazer lens merkezinden geçer ki. </li><li> Kiriş paralelleştirilmesini ayarlamak için ışın yolu boyunca L3 Çevir. Kiriş hala monitörde merkezli ve şekli simetrik olduğundan emin olun. NOT: TIR lens odak uzunluğunun azaltılması ile örnek düzlem artar aydınlatma alanı. Genel olarak, set-up sığabilir küçük odak uzunluğunu kullanın. </li><li> Amacın kirişi yatırmak için ışın yoluna dik, L3 çevirir. TIR elde edilir, öyle ki, TIR lens tercüme edin. Iyi SNR almak için EMCCD kamera ve ince ayar L3 ile floresan boncuk örneği gözlemleyin. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500" /> Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için 1. Optik yapılandırmasını Şekil. Cy3 DNA 2. FIONA <ol><li> Cyalın mikroskop slaytlar ve lamelleri: GKD 2 O ve izopropanolle mikroskop slaytlar ve lamelleri durulayın ve azot gazı ile kurulayın; Ar plazma altında 5 dakika boyunca plazma temizleyici slaytlar ve lamelleri yerleştirin. </li><li> (Şekil 2 kabataslak) örnek odalarını Construct. <ol><li> Bankta bir doku yerleştirin ve sonra doku üstüne objektif bir parça kağıt koyun. Objektif kağıt üzerinde slayt yerleştirin. Slayt temiz tarafı yukarı olduğundan emin olun. </li><li> Merkezinde 3-5 mm arasında bir boşluk bırakarak, uzun kenarları boyunca slayt üzerine çift taraflı bant ile iki şerit uygulanır. Slayt üstüne temizlenmiş lamel yerleştirin. Lamel temiz tarafı slayt baktığından emin olun. </li><li> Çift taraflı bant üzerinde aşağı basmak için pipet kullanın. Bant sadece coverslip altında kalacak şekilde slayt aşırı bandı çıkarmak için bir jilet kullanın. Not: bölmesinin açık uçları açık bırakılır ve benzeri gibi giriş ve çıkış hizmet verirlerlet. Kamara hacmi birkaç mikrolitredir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500" /> Tipik bir örnek odasının Şekil 2. Eskiz: (a) en görünüşüdür. (B) sağdan Yandan görünüm; Ön (c) yan görünüşüdür. <ol start="3"><li> Örnek odalarının iç yüzeyleri üzerinde Cy3 DNA hareketsiz. <ol><li> T-50 tamponu (10 mM Tris-HCI pH 8.0, 50 mM NaCI) hazırlayın. 1 mg / ml nihai konsantrasyonda, T-50 BSA-biyotin hazırlayın. 10 mg / ml nihai konsantrasyonda, T-50 BSA çözülerek T50-BSA tamponu hazırlayın. </li><li> 0.5 mg / T50-BSA tamponu ml NeutrAvidin hazırlayın. 5-10 pM nihai konsantrasyonda biyotinile Cy3 etiketli DNA T50-BSA içinde (Cy3-DNA) hazırlayın. </li><li> Örnek odasına pipetle 10 ul BSA-biyotin (1 mg / ml). 5 dakika bekleyin. </li><li&gt; 40 ul T50-BSA ile bölmesi yıkayın. Örnek odasına pipetle 10 ul nötravidin (0.5 mg / ml). 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 40 ul T50-BSA ile bölmesi yıkayın. Numune bölmesindeki balona, ​​20 ul Cy3 ile DNA arasında değişir. 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 80 ul T50-BSA ile bölmesi yıkayın. </li></ol></li><li> Resim Cy3 DNA TIRFM altında, bir molekülleri. <ol><li> 50 ul 6-hidroksi-2,5,7,8-, 1 ul Protocatechuate-3,4-dioksijenazı (PSD, 5 uM), 4 ul protokateşuik asit (ABA, 62.5 mM) ile muamele görüntüleme tamponu (100 ul) hazırlayın tetrametilkroman-2-karboksilik asit (T-50 olarak Trolox®, 2 mM) ve 45 ul T50-inkübe edilmişlerdir. </li><li> Ve 30 ul görüntüleme tamponu Pipet 8-10 dakika bekleyin. </li><li> Yeşil lazer (532 nm) ile donatılmış bir TIRFM üzerinde görüntüleme için örnek montaj, 100X immersiyon yağı objektif (1.45 NA) ve bir EMCCD kamera. </li><li> 1,0 için örnek bir film Edinme 100&#39;e 100 ile 500 msn ve 25 EM kazanç pozlama süresini ayarlayın00 kare. </li></ol></li><li> Cy3-DNA kaydedilen görüntülerde Fiona veri analizi yapın. <ol><li> Etkin piksel boyutunu belirlemek (yani nanometre piksel dönüşüm faktörü) fiziksel piksel boyutunu bölerek toplam büyütme (herhangi bir ekstra büyütmelerle çarpılır mikroskop objektif büyütme) tarafından (EMCCD kamera özellikler sayfasında okur). </li><li> CCD hassasiyetini görüntü alımı sırasında kullanılan (yani, CCD kamera özellikler sayfasında okumak, A / D sayımı, başına elektronlar) elektron çarpanı (EM) kazanç bölerek sayıları foton piksel yoğunluğunun gelen dönüşüm faktörünü belirlemek. </li><li> Derleme ve Fiona analiz için FIONA.pro çalıştırın. Girişi (Adım 2.5.1 &#39;dan itibaren) etkin piksel boyutu ve (Adım 2.5.2&#39; dan itibaren) foton sayısına yoğunluğundan dönüşüm faktörü, elde edilen görüntüyü almak için bu IDL programı kullanın ve Fiona analiz için noktalar seçin. Not: Sonunda, programmingm irade çıktı 2B Gauss fonksiyonlarının yanı sıra, toplam foton numaraları ve yerelleştirme hassasiyetle uydurma sonuçları. Tipik bir sonuç temsilcisi sonuçları ve Şekil 4c-4d bölümünde gösterilir. </li><li> Derleme ve foton sayımı karakterize etmek phcount.pro çalıştırın. (Adım 2.5.2 &#39;dan itibaren) foton sayısına yoğunluğundan alınan görüntü ve girişe dönüşüm faktörü ithal etmek, ışıkla önce flüorofora tarafından yayılan fotonların ortalama sayısını ölçmek için bu IDL programı kullanın. NOT: Program daha sonra, (manuel seçim bir seçenek) otomatik floresan noktalar tespit çerçeve sayıda fonksiyonu ve çıkış olarak foton sayımı izlerini foton sayısı hesaplar. <ol><li> Kötü izleri atın ve temel düzeltme için ışıkla sonra kare aralıkları belirtin. Sonunda, program çıktısı tüm noktalar için toplam foton numaralarının listesi değildir atılır olacaktır. Daha sonra foton sayıları dağılımını çizmek ve dağılımının uygunBir üslü ile yon ortalama foton numarasını elde etmek. Tipik bir sonuç temsilcisi sonuçları bölümünde gösterilen ve 4e-4f Rakamlar edilir. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Fiona Uygulamalı Nanometre Ölçeğinde Motor (örneğin, Aktin üzerinde miyozin) Dynamics belirlememize <ol><li> Aktin polimerize Fiona deneyden bir gün önce (yani F-aktin hazırlamak). <ol><li> Genel aktin tamponu ile mi, 10 mg / G-aktin (monomer) ve biyotin G-aktin (monomer) sulandırın. De tamamen çözülmüş olduğundan emin olun, ve buz üzerinde hem tutmak için karıştırın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 1.7 ul biyotin, G-aktin 10 ul, G-aktin (monomer) karıştırın. 100 ul buz gibi soğuk tampon aktin polimerizasyonu ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece beklettikten sonra (F-aktin oluşturulan) ve daha sonra 1 ml bir toplam hacme GKD 2 O ekleyin. </li><li> Deneylerde daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C &#39;de aktin filamanlarını (F-aktin) saklayın. NOT: Filamentler parçalanır ve zaman içinde kısaltmak, ancak en az iki hafta boyunca kullanılabilir olacaktır. </li></ol></li><li> Görüntüleme için örnek hazırlayın. <ol><li> (Protokol 2.1 ve 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi), bir numune haznesi yapın. Ile kombine edilmiştir 2 O 1 mg / ml BSA, 20 ul biyotinile edilmiş Pipet 10 dakika boyunca inkübe edin. 30 ul GKD 2 O. ile durulayın NOT: Bu bloklar, cam yüzeyi ve aktin filamentler bağlanması için biotin belirlemektedir. Biyotinile edilmiş, poli-L-lisin - polietilen glikol (PEG-PLL) ile aynı fonksiyonu görür. </li><li> 0.5 mg / ml nötravidin Pipet. 2 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 30 ul M5 tamponu ile bölmesini yıkayın. </li><li> Hazırlanan F-aktine Pipet nihai konsantrasyon ~ 0,004 mg / ml ila genel aktin tamponu içinde 25 kez seyreltilmiştir. , 10 dk bekleyin 30 ul tamponu ile odasını durulayın. </li><li> A bir nihai konsantrasyonu o M5 tamponu (20 mM HEPES (pH 7.6), 2 mM MgCI2, 25 mM KCI, 1 mM EGTA) içinde FLAG etiketleri ile 30 kat seyreltiniz Va miyosinf 250 nM. (Üreticisinden kullanma kılavuzuna göre Qdot705 Antikor Birleşme Kit kullanarak Anti-FLAG antikorlar ve Qdot705 gelen konjuge ~ 1 mcM) 1 ul Anti-FLAG-Qdot705 ile 1 ul miyozini karıştırın. 10 ul doldurmak için 8 ul M5 ekleyin. Pipet ve aşağı yukarı iyice karıştırın. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. NOT: Bu ~ 25nM miyosin konsantrasyonda kullanıldığında, 1 ila 4, motor kuantum noktaları bir karışımını verir. </li></ol></li><li> Aktin üzerinde yürüyen miyozin görüntüleme. <ol><li> Karıştırılarak görüntüleme tamponu (100 ul) hazırlayın 84 ul M5, BSA (1 mg M5 tampon / ml BSA), 1 ul ATP (GKD 2 O 50 uM), 2 ul DTT (500mM GKD 2 O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul CP (200 mM), 1 ul PCD, 4 ul PCA, 1 ul miyozin Qdot sonra 2.5 nM miyozin konsantrasyonu ve 1 ul BME için başka bir 10-kat seyreltilmiştir. </li><li> 20 ul görüntüleme tamponu Pipet odasını örnek ve 8-10 dakika inkübe. </li><li> Görüntü T örnek30 msn pozlama IRF mikroskop. En az 1000 kare edinin. Gerekirse Adım 3.3.1 miyozin-Qdot seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> Veri analizi yapın ve miyozin yürüme adım boyutunu bulabilirsiniz. <ol><li> ImageJ 17 video dosyasını açın ve hareketli bir nokta etrafında video kırpmak. Spot asla kenarının 20 piksel içinde alır yeterince büyük bir alanı kırpmak ve video başka noktalar vardır emin olun. Bu noktada doğrusal bir yolda hareket emin olun. </li><li> X oluşturmak için video aracılığıyla noktayı izlemek ve y her ve videonun her karesine Fiona analizi (Adım 2.5.3) uygulayarak, piksel, zaman içinde koordinatları. </li><li> Önceki bölümde açıklandığı gibi, nanometre pikselleri dönüştürün. </li><li> Zamanın bir fonksiyonu olarak başlangıç ​​konumundan yer değiştirme hesaplayın. </li><li> Miyozin yürüyüş adımları edinmek için deplasman t-testi çalıştırın. Not: t-testi (step_t_test.zip) için sunulan program IDL ve con kodlanmıştırklasörde bulunan 14 altrutinlerin ibarettir. <ol><li> IDL altrutinlerin tüm açın ve iki kez tüm derlemek. Sonra mtltyanalysis_ttest.pro çalıştırın ve tek bir sütunda sadece uzaklık verilerini içeren bir metin dosyasını seçin. Bir çıkış Excel dosyası ham veri, uyum ve adım boyutunu içeren, oluşturulur. </li></ol></li><li> Adım boyutu sütundaki tüm sıfır değerleri silin. Kökeni veya MATLAB kullanarak adım boyutları dağılımını çiziniz. Histograma bir Gauss takın. Not: sıfır arasında değişen aşamalı bir adım yok önceki çerçeveden alınır anlamına gelir, çünkü sıfır değerleri Adım boyutları silinmesi gerekir. (Şekil 5&#39;de gösterildiği gibi) uygun 36 nm civarında bir tepe noktası verir. </li></ol></li></ol> FIONA 4. Numune Hazırlama Kalın <ol><li> Sol-jel kapsüllü kuantum noktalar hazırlayın. <ol><li> Karıştırın 4.5 mi TMOS, 1 mi GKD 2 O ve 100 ul HCI (120 mM) getirilmiştir. Ultrasonik temizleyici sp 30 dakika boyunca buz üzerinde karışımın sonikasyonMalzeme Listesi ecified (frekans = 40 kHz, ısıtıcı = off). Çözüme her 10 dk karıştırın. </li><li> 1.5 mi HEPES (50 mM, pH = 7.2) içinde 1.5 ul Qdot605 seyreltin. Önceki adımdaki 1.5 ml TMOS ile çözüm karıştırın. </li><li> Bir cam alt çanak içine karışımı dökün. 1. 5 saat boyunca 4 ° C&#39;de cam alt Parafilm ile çanak ve mağaza mühür. </li><li> Numune çanağı PBS içerisinde 2 ml% 1 BME ekleyin ve görüntüleme önce 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> Kuantum noktaları ile boyandı kornea örnek hazırlayın. NOT: Tavşan gözler Dr Marina Marjanovic gelen hediyeler vardı. <ol><li> Gözlerden kornea ayırın ve 3 mm x 3 mm parçalar halinde kesin. </li><li> 1 ml PBS içinde 1 ul streptavidin-Qdot 605 seyreltin. 4 ° C&#39;de 1 nM Qdots çözeltisi ile kornea doku inkübe 1 saat boyunca ° C. PBS ile doku yıkayın. </li><li> Temiz bir cam slayt ve # 1.5 lamel alın. , Uzun kenarı boyunca cam slayt üzerine çift taraflı bant 4 katmanları koymaknd önceki bant çift taraflı bant paralel başka bir 4 kat koymak ve aralarında yaklaşık 1 cm bir kanal bırakın. Kanalın ortasında içinde önceki aşamada elde edilen doku koyun ve bir lamel ile örtün. </li><li> Yavaşça lamel tarafta basın o kasetleri sopa yapmak. Görüntüleme önce 50 ul PBS ile kanal ıslatın. </li></ol></li><li> Sol-jel ve korneada Görüntü kuantum noktalar. <ol><li> Kalın örneklerinde Fiona görüntüleme için, 0.27 mm veya 0.28 mm çalışma mesafesi ile 60X su daldırma hedefi çalışma mesafesi ile 60X su daldırma objektif kullanın. </li><li> Mikroskop örnek monte edin. Bu epi-floresan modu ulaşacak şekilde TIRF lens ayarlama (yani, lazer ışını lamel karşı açı objektif çıkar). Ekstra bir büyütme merceği (3.3X veya 4.0x) takın. </li><li> Istenen z konumuna (örneğin&gt; 200 mikron) için hedefi odak düzlemini hareket ettirin. Hareketsiz rekor görüntülerinumunede kuantum noktalar. </li></ol></li><li> Bu protokolün 2.5 bölümünde açıklandığı gibi Fiona analizi yapın. </li></ol>

<ol>
	<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope.">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope+(continued).">The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued).</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).</li><li>Thompson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+Walks+Hand-Over-Hand:+Single+Fluorophore+Imaging+with+1.5-nm+Localization.">Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li><li>Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Walks+Hand-Over-Hand.">Kinesin Walks Hand-Over-Hand.</a> Science. 303 (5658), 676-678 (2004).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+VI+Steps+via+a+Hand-over-Hand+Mechanism+with+Its+Lever+Arm+Undergoing+Fluctuations+when+Attached+to+Actin.">Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).</li><li>Yildiz, A., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Imaging+with+One+Nanometer+Accuracy:+Application+to+Molecular+Motors.">Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).</li><li>Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+kinesin+is+so+processive.">Why kinesin is so processive.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+melanosomes+inside+a+cell+to+study+molecular+motors+and+their+interaction.">Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).</li><li>Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+high-resolution+imaging+with+photobleaching.">Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).</li><li>Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer-localized+multiple+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).</li><li>Churchman, L. S., &#214;kten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+high-resolution+colocalization+of+Cy3+and+Cy5+attached+to+macromolecules+measures+intramolecular+distances+through+time.">Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Super-Resolution+Imaging+with+Photo-Switchable+Fluorescent+Probes.">Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Abramoff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).</li><li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization.">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li><li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles.">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding.">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Fiona 1 msn 4 8 aşağı nanometre hassas ve zamansal çözünürlüğe sahip bir floresan yayıcı (organik flüorofor ya da kuantum nokta) konumunu lokalize bir tekniktir. Yeterli fotonlar toplandığı zaman, bu tekniğin çok daha doğru kırılma sınırı (~ 200 nm) daha floresan emitörün konumunu belirlemek için izin verir ve bu nedenle bu tekniği geleneksel / konvansiyonel optik mikroskopi 4 ile görülmemiştir ne gözlemlemek için bir yol açar - 8. Onun icadından bu yana...

1882 civarında, Ernst Abbe bir görünür ışık mikroskobu çözünürlüğü olduğu bulundu ~ λ / 2NA, (λ dalga boyu ve NA sayısal açıklık olduğu) 1,2 ~ 200 nm veya. Bu nedenle, bu boyutundan daha küçük bir amacı, bir optik mikroskop bir kırınım sınırlı bir leke olarak görülecektir. Bununla birlikte, daha yüksek bir hassasiyet ile 3, bir nokta merkezini, nesnenin konumunu belirlemek mümkündür. Bir nanometre doğruluk (Fiona) ile floresan görüntüleme xy düzleminde 4 nanometre hassasiyetle tek florosforlar lokalize için basit ama kullanışlı bir tekniktir. Lokalizasyon hassasiyet, σ μ (yani, ortalamanın standart hatası) toplandı, fotonların sayısına bağlıdır <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" /> N foton sayısı olduğu, s floresan noktanın standart sapmasıdır, a,piksel görüntü detektörünün büyüklüğü, ve b, 3,4 arka standart sapmasıdır. ~ 10.000 fotonları yayan bir flüorofora için, Fiona ~ 1 nm hassasiyet 4 elde edebilirsiniz. FIONA hassas bir şekilde sabit bir yayıcı konumunu, ya da (yeterince hızlı alınabilir görüntü varsayılarak) hareketli bir belirlemek için kullanılabilir. Fiona filmin kareleri sırayla uygulanan ve böylece tek bir molekülün 4 8 hareketini takip edilebilir. Foto-koruyucu reaktifler örnek ışıkla olmamasını sağlamak için gerekli olabilir. Ayrıca, flüoresan nesnenin kendisi herhangi bir boyutta olabilir, örneğin kısıtlayıcıları kırınım daha küçük ya da daha büyük, kendi zar üzerinde dağıtılmış çok sayıda floresan proteinleri ile bir organel (~ 1 mm) teşekkül edebilir. Fiona hala ortalama merkezden-of-kütlesinin çok doğru (nanometre) ortalama verim kullanma. FIONA tarafından yerelleştirme hassasiyetle büyük bir gelişme nanome çözme sağlarzaman içinde tert-ölçekli hareketleri. Bu moleküler uzunluk ölçüsü 4 8 içine mikroskopi itti. Onun icadından bu yana, Fiona çeşidi geliştirilmiştir. Örneğin, parlak-alan bir-nanometre doğruluk (bFIONA) 9, FIONA hafif bir varyantı, görüntüleri ile görüntüleme ve iletilen ışık ile böyle Melanozomlar in vivo (pigment melanin içeren koyu nesneler) gibi yoğun nesneleri lokalize. Buna ek olarak, birden fazla boyayı Fiona gidermek için kullanılmıştır. Örneğin, ışıkla ağartma (karides) ile birlikte tek bir molekül yüksek çözünürlüklü bir 10,11 veya tek molekül yüksek çözünürlüklü ko (SHREC) 12 yaklaşık 10 nm olan, iki boya çözmek için geliştirilmiştir. (Bu kararın bu bir arayla aynı boyaları söyleyebilirim ne kadar doğru, yani dikkat edin.) Daha yakın zamanlarda, Fiona analizi bazı süper çözünürlük mikroskopi yerelleştirme sürecine katkıda böyle Stokastik optik reco gibinstruction mikroskobu (STORM) 13-15 ve geçici koyu flüoroforlar heyecan ve floresan lokalize edildiği fotoaktif localisation mikroskobu (PALM) 16,. Defalarca heyecanlı oldukça düşük boyaların yoğunluğu (az bir başına kırılma sınırlı nokta), ve daha sonra FIONA her bunların analiz, floresan toplayarak, tek bir yüksek çözünürlüklü haritayı kurabilirsiniz. Çözünürlüğü sonra sadece her bir boya dışarı koyar fotonların sayısı, yanı sıra satın alma sırasında (örneğin dahil, mikroskop sahne) numune sabit tutmak gibi şeyler sınırlıdır. Bu makalede, bir Fiona tekniğin bir özeti ve kısaca Fiona bildirilmektedir kullanılarak yapılmıştır araştırma örneklerini tarif eder. İlk olarak, nasıl optik hizalama hakkında ayrıntılar yani Fiona deneylerde, toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için gerekli ekipman kurmak, tarif edilir. Sonra nasıluygun protokolleri kullanarak hareketsiz Cy3-DNA tek moleküllerini lokalize basit Fiona deneyi yürütmek, gösterilmektedir. Bundan sonra, Fiona&#39;yla kullanımı kuantum nokta ile işaretlenmiş tek bir tepe bölümü kesik miyozin Va motorun 36 nm aşaması boyutunu ölçmek için sunulmuştur. Miyozin Va aktin filamentler boyunca translocating Hücresel kargo taşıyan bir temel süreçsel motoru proteindir. Burada Va kesik oluşturmak miyozin adım boyutuyla ilgisiz etki ayrılması için kullanılan ve bir FLAG etiketi C-terminaline ilave Anti-Flag antikorları ile işlevselleştirilmiş kuantum noktaları ile etiketleme kolaylığı sağlamak için. Bu deney miyozini yavaşlatmak ve her karede iyi bir foton sayısı almak için yeterince uzun pozlama süreleri kullanımına izin düşük ATP altında yapılır. Herhangi yeterince parlak floresan etiket aşağıdaki protokolde ikame edilebilir. Son olarak, kalın örnekleri FIONA uygulamasını uzanan son çaba bildirdi. Proof-of-prensip olarak, kuantum noktalar batırılmışSol-jel ve tavşan gözü kornealar ve sonra yansıması ve FIONA&#39;sı kullanılarak lokalize. Görüntüleme için, NA ile 60X su daldırma objektif bu hedefi daha önceden kullanılan 100X immersiyon yağı hedefi daha uzun çalışma mesafesi vardır, çünkü 1.2 kullanıldı =. Objektifine büyütmede kaybını telafi etmek için fazladan bir büyütme merceği (3.3X veya 4.0x) emisyon yoluna yerleştirilen edilmiştir. Buna ek olarak, epi-floresans (değil TIR) mikroskopisi kalın örneklerde derin bölgeleri ulaşmak için kullanılması gerekir. Bu sol-jel ve 2-3 nm hassasiyetle lokalize edilebilir tavşan gözü kornealar (Z&gt; 200 mikron) derin batırılmış kuantum noktalar gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1083">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:211px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:443px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:211px;">3M</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>~ 75 um thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:211px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:211px;">DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Branson</td>
			<td style="width:211px;">2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescence filter set</td>
			<td style="width:211px;">Chroma</td>
			<td style="width:211px;">49016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Actin polymerization buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Biotin G-actin</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AB07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">G-actin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AKL95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">General actin buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser shutter (with driver)</td>
			<td style="width:211px;">Electro-Optical Products Corp.&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SH-10-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">IDL</td>
			<td style="width:211px;">Exelis Visual Information Solutions</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Neutravidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">PI-31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Coverslip</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:211px;">22X30-1.5</td>
			<td>0.16-0.19 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:211px;">Gold Seal Microslides&#160;</td>
			<td style="width:211px;">30103X1</td>
			<td>0.93-1.05 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:211px;">PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Glass bottom dish&#160;</td>
			<td style="width:211px;">In Vitro Scientific</td>
			<td style="width:211px;">D35-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Cy3-DNA oligos</td>
			<td style="width:211px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>5&#39;-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3&#39;Bio</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent beads&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">T-7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot 605-streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q10101MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot605&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q21301MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot705</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22021MP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Qdot705 Antibody Conjugation Kit</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Matlab</td>
			<td style="width:211px;">MathWorks</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical table</td>
			<td style="width:211px;">Newport Corp</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>RS4000 Series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:211px;">Plan Apo VC 60x WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">100X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">PlanApo 100X/1.45 Oil &#8734;/0.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">UPlanApo 60X/1.20W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">IX71/IX70/IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Origin</td>
			<td style="width:211px;">OriginLab</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Anti-FLAG antibody</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">F7425-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ATP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BME&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA-biotin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CK</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">C3755</td>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P1937</td>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">DTT</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">43815</td>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EGTA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">E3889</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">KCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">MgCl2</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">NaCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">03930590</td>
			<td>Protocatechuic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCD</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P8279</td>
			<td>Protocatechuate-3,4-dioxygenase&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">TMOS</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">341436-25G</td>
			<td>Tetramethyl orthosilicate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Trolox</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">238813</td>
			<td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">1&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB1-E02, KM100</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">&#189;&#8221; diameter posts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TR4</td>
			<td>Quantity &#8805; 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">10x beam expander</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BE10M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB2-E02, KM200</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter f = 300 mm lens with mount</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LA1256-A, LMR2</td>
			<td>TIR lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent alignment target&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">VRC2SM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser safety goggles</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LG3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ND filter(s)</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical beam profiler</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BP209-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Post-mounted iris diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">ID25</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">XYZ translation stage, &#189;&#8221; travel&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">T12XYZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser</td>
			<td style="width:211px;">World Star Technologies&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TECGL-30</td>
			<td>532 nm, 30 mW</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)

Bir nanometre doğruluk (Fiona) ile floresan görüntüleme xy düzleminde nanometre hassasiyetle tek florosforlar lokalize için basit ama kullanışlı bir tekniktir. Burada FIONA tekniğin bir özeti ve rapor edilir FIONA&#39;sı kullanılarak yapılmıştır araştırma örnekleri kısaca tarif edilmektedir. İlk olarak, nasıl optik hizalama hakkında ayrıntılar yani Fiona deneylerde, toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için gerekli ekipman kurmak, tarif edilir. O kadar bir kuantum nokta ile işaretlenmiş tek bir tepe bölümü kesik miyozin Va motorun 36 nm Adım boyutunu ölçmek için FIONA kullanılması, ardından uygun olan protokolü kullanılarak immobilize Cy3 DNA tek molekülleri lokalize basit Fiona deneyi yürütmek için görüntülenmiştir. Son olarak, kalın örnekleri FIONA uygulama genişletmek için son çaba bildirilmiştir. &gt; (Bu bir suya daldırma objektif kullanılarak, olduğu gösterilmiştir ve kuantum noktaları, sol-jel ve tavşan gözü kornealar derin batırılmış200 um), 2,3 nm yeri hassas elde edilebilir.

Tipik amaç tipi TIRFM kurulumu, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. İlk olarak, yüzey hareketsizleştirilmiş Cy3 DNA örneği görüntülenmiştir. Tipik bir görüntü Şekil 4a&#39;da gösterilmektedir. Görüntü EM kazanç = 50 ve CCD hassasiyet = kamera için 12,13 ile, pozlama süresi ile 0.5 sn alınmıştır. Tek bir Cy3 ile DNA molekülünün bir nokta-yayılmış bir fonksiyonu (PSF) Şekil 4b&#39;de gösterilmiştir renk çubuğu piksel yoğunluğunun öl?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA at JoVE.com

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Tek flüoroforlar FIONA&#39;sı kullanarak nanometre hassasiyetle lokalize edilebilir. Burada FIONA tekniğin bir özet bilgi ve nasıl Fiona deneyleri tarif edilir.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

fluorescence-imaging-with-one-nanometer-accuracy-fiona

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

17.6K Görüntüleme.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Tek flüoroforlar FIONA'sı kullanarak nanometre hassasiyetle lokalize edilebilir. Burada FIONA tekniğin bir özet bilgi ve nasıl Fiona deneyleri tarif edilir. 

Video: Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Mikrosirkülasyon intravital Floresans Görüntüleme Microiontophoresis ve Mikromanipülasyon

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Enteroendokrin Hücre Gut Hormon salgısını Çalışması ve Canlı Hücre Görüntüleme için Amaçlanan Kemirgen Küçük Bağırsak Karışık İlköğretim Kültürler

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Photobleaching, sarı floresan Protein etiketli p62 indüklenen Aggresome benzeri yapılarda sonra Floresans kurtarma

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...