Makropinositoz, kanser metabolizması da dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçler için önemli olan endositotik bir yoldur. Bu protokol, in vitro hücrelerde makropinositozun kapsamını ölçmenizi sağlar. Otomasyon, tekrarlanabilirliği, üretkenliği en üst düzeye çıkarmayı ve deneysel varyasyonu azaltmayı amaçlamaktadır.
Ayrıca, floresan mikroskopi, deneysel kaliteyi belirlemek ve ek makropinozom özelliklerini değerlendirmek için numuneyi görsel olarak incelemenizi sağlar. Prosedürü benimle birlikte gösteren cheska Marie Galapate, laboratuvarımdan bir araştırma asistanı. Kapak kılıfı formatındaki 24 kuyu plakası için, etanol banyosundan tek bir kapak sapını kavramak için forseps kullanın.
Fazla etanol çıkarmak için kapak kılıfını plakanın iç duvarına dokunun ve kapak kapağını kuyunun dibine düz yerleştirin. Etanol buharlaştıktan sonra, kapak kapağını DPBS ile iki kez yıkayın, ardından her kuyuya 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyerek kapak kapağının üzerine tohum sürün. Makropinozom etiketlemesinden önceki gün hücre konflüensi % 60 ila% 80'e ulaşana kadar hücreleri% 5 karbondioksitli 37 santigrat derecelik bir hücre inkübatörüne yerleştirin.
Makropinozom etiketlemeden bir gün önce, kuyulardaki ortamı önceden ısıtılmış 500 mikrolitre serumsuz ortamla değiştirin ve hücreleri 16 ila 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin. 96 kuyulu mikro plaka formatı için, hücre süspansiyonu 25 mililitrelik bir reaktif rezervuarına aktararak başlayın. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, optik olarak net siklik olefin veya cam tabanlı siyah 96 kuyulu yüksek içerikli bir tarama mikro plakasının her kuyusuna hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini tohumlar.
Makropinozom etiketlemesinden önceki gün hücre konfluensi %60 ila %80'e ulaşana kadar hücreleri kuluçkaya yatırın. Makropinozom etiketlemeden bir gün önce, vakum pompasına bağlı standart uçlar için çok kanallı aspirasyon adaptörü kullanarak ortamı her kuyudan çıkarın ve atın. Alternatif olarak, çok kanallı bir pipet kullanılabilir.
Bir reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet kullanarak, her kuyuya 100 mikrolitre önceden ısıtılmış serumsuz ortam ekleyin, ardından hücreleri 16 ila 24 saat boyunca hücre inkübatörüne yerleştirin. Kapaklı formatlı 24 kuyu plakası için kuyulardaki ortamı 200 mikrolitre serumsuz ortamla florofor etiketli yüksek moleküler ağırlıklı dektran ile değiştirin ve hücreleri 30 dakika boyunca hücre inkübatörüne yerleştirin. Kuluçkadan sonra, ortamı aspire edin ve önceden soğutulmuş bir yıkama şişesi kullanarak hücreleri buz gibi soğuk PBS ile beş kez hafifçe ama hızlı bir şekilde yıkayın.
Kapak örtülerine yapışan dektran agregalarının yerinden çıkmalarına yardımcı olmak için yıkamalar sırasında plakayı elle sıkıca çalkalayın. Daha sonra, % 3.7 formaldehit 350 mikrolitre ekleyerek ve 20 dakika kuluçkaya yatırarak hücreleri sabitleyin, ardından fiksasyon çözeltisini epire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de çekirdekleri 350 mikrolitre DAPI ile lekele.
20 dakika sonra, DAPI çözeltisini aspire edin ve hücreleri PBS üç kez yıkayın. Görüntüleme otomasyonu için gereken kapak örtülerinin aralıklarını ve tekrarlanabilir lokalizasyonunu elde etmek için silikon izolatörleri mikroskop kaydırağı üzerine yan yana yerleştirin. Ardından, her kapak için, izolatörnün açık alanı içindeki mikroskop kaydırasına bir damla sertleştirici floresan montaj ortamı ekleyin.
Tiftiksiz bir mendilin üzerindeki kapak uçlarının yanına hafifçe dokunarak, tokmak kullanarak bir kapak kapağı alın ve fazla PBS'yi çıkarın. Ardından, kapak kapağını montaj medyasının damlasına baş aşağı yerleştirin ve kabarcıkları montaj medyasından çıkarmak için kapalı kanat uçlarını kullanarak kapak kapağına hafifçe dokunun. Slaytları karanlık bir ortamda saklayın ve montaj ortamının oda sıcaklığında kurumasını bekleyin, genellikle 16 ila 24 saat sürer.
Görüntülemeden önce, izolatörleri mikroskop slaydından çıkarın. Slaytlar oda sıcaklığına dengelendikten sonra, amonyak içermeyen cam temizleyici ile ıslatılmış pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak kapakları temizleyin. Daha sonra, kapak kapağını temizlemek ve kuru bırakmak için% 70 etanol ile ıslatılmış temiz bir pamuk uçlu aplikatör kullanın.
96 kuyu mikro plaka formatı için, kuyuları daha önce gösterildiği gibi aspire ettikten sonra, kuyulara florofor etiketli yüksek moleküler ağırlık dektranı ile 40 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin, ardından hücre inkübatöründeki hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, plakayı manuel olarak beş litrelik boş bir beş litrelik bir kabın içine baş aşağı kaydırarak mikro plakadaki ortamı atın, ardından plakayı hafif bir açıyla hafifçe batırarak hücreleri ve mikro plakayı iki kez durulayın ve daha sonra plakayı beş litrelik beherin içine baş aşağı kaydırarak PBS'yi mikro plakaya atın. Son PBS durulamadan sonra, 25 mililitrelik reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya PBS'de% 3,7 formaldehit 100 mikrolitre ekleyerek hücreleri sabitlayın.
Oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyondan sonra, sabitleme çözeltisini çıkarın ve batırma ve kaydırma tekniğini kullanarak hücreleri PBS ile yıkayın. İkinci PBS yıkamadan sonra, çekirdeği kuyu başına PBS'de 100 mikrolitre DAPI ile lekelenin. 20 dakika sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi buz gibi PBS ile üç kez durulayın.
Mikro plakayı baş aşağı tiftiksiz bir mendile dokunarak kalan PBS'leri çıkarın. Ardından 25 mililitrelik reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 100 mikrolitre taze PBS ekleyin. Görüntülemeden önce, plakanın oda sıcaklığına eşdeğer olmasını bekleyin, ardından hücre kültürü plakasını tüy bırakmayan bir mendille kurulayın.
Alternatif olarak, ışıktan uzak kaplanmış plakayı bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Otomatik makropinozom görüntüleme için, dektran floroforunun dalga boyu kanalında 40X hava hedefi olan görüntüleri elde etmek için bir otomasyon protokolü oluşturun. Ardından, aşırı pozlamayı önlemek için en yüksek makropinositoz seviyesine sahip olduğu tahmin edilen bir örnek kullanarak pozlama ayarlarını optimize edin, bu da sinyalin doygunluğuna ve yoğunluk verilerinin kaybına neden olabilir.
Yüksek kaliteli görüntüler üretmek için örneği kolayca ve tutarlı bir şekilde konumlandıran odak ayarlarını kullanın. Örnek değişkenliğini hesaba katmak ve numunenin doğru bir gösterimini elde etmek için her kuyuda veya kapak kapağında birden fazla görüntü elde edin. Makropinositik dizini belirlemek için, sık sık yuvarlanan top işlevi olarak adlandırılan uygun işlevi uygulayarak DAPI ve karşılık gelen dektran görüntüsünün arka planını çıkarın.
Dapi ve dextran sinyali üzerinde çıkarma etkisi olmadan arka plan gürültüsünün en aza indirilmesi için ayarları yapın. Ardından, yüksek dektran sinyaline sahip bir alan kullanarak, çekirdeği seçmek için sık sık eşik işlevi olarak adlandırılan yoğunluk sinyali ayarlarını belirleyin, ardından yalnızca makropinozomları seçmek için gereken minimum yoğunluk sinyali ayarını belirleyin. Dektran görüntüsü için, oluşturulan makropinozom seçimi içindeki toplam floresan hesaplamayı hesaplayın veya dektran için pozitif olan toplam alanı belirlemek için seçimi kullanın.
DAPI görüntüsü için, mevcut hücre sayısını yansıtmak üzere görüntüdeki çekirdek sayısını belirlemek için seçimi kullanın. Daha sonra toplam dektran floresanını veya alanını DAPI tarafından belirlenen hücre sayısına bölerek makropinositik indeksi belirleyin. AsPC-1 PDAK hücrelerinde, dektranı eklemeden önce beş dakika boyunca mililitre başına 100 nanogramda EGF eklemek makropinositozu aktive eder.
Ayrıca, makropinositozun otokrin EGF aktivasyonu 16 ila 24 saat boyunca glutamin yoksunluğu ile indüklenebilir. MIA PaCa-2 hücreleri, 75 mikromoler EIPA ile 30 dakikalık bir tedavi veya 10 mikromoler EHop-016 ile iki saatlik bir tedavi ile inhibe edilen konsitutive makropinositoz göstermektedir. Bir doz yanıt deneyinde, makropinositik indeks EHop-016 ve EIPA'nın daha yüksek ilaç konsantrasyonlarında kademeli olarak azaldı ve böylece constitutive Rac1-dependent macropinocytosis'in varlığını doğruladı.
Bu prosedürü albümin gibi floresan etiketli diğer kargoların makropinositozlarını değerlendirmek için uyarlayabilirsiniz. Ayrıca albümin makropinositik alımının hücre canlılığı tahlilleri yapılarak hücre zindeliğine katkıda bulunup bulunmadığının değerlendirilmesi önerilir. Bu teknik, kanser ve stromal hücrelerde makropinositik besin kaynağının tanımlanmasında merkezi olmuştur ve otomasyon durum test kapasitemizi büyük ölçüde artırmıştır.
