3D biyoreaktörümüzü kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu eksozomlar ekzozom biyolojisi araştırmalarında ve klinik artrit tedavisinde kullanılabilir. Prosedürü gösteren Dr. Yujie Liang olacak.
İnsan mezenkimal hücrelerini veya MSC'leri, sinovyal sıvıyı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüj ederek toplamaya başlayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 10 mililitre PBS ile yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüj yapın ve peleti 10 mililitre insan MSC kültür ortamı ile beş kez 10 hücre yoğunluğunda mililitre başına dördüncü hücrelere yeniden askıya almadan önce PBS'yi atın ve ardından süspansiyonu 100 milimetrelik bir kapta tabaklayın.
Yemeği% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde 37 santigrat derecede inkübe edin. İki hafta sonra, akış sitometrisini kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerini veya SF-MSC'leri tanımlamak için hücre kültürü süpernatantını toplayın. Bunu yapmak için, SF-MSC'lerin üçüncü nesil geçişini, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüjleme yoluyla sindirin.
Ardından, hücre peletini toplamadan önce süpernatantı atın. Daha sonra, hücre peletine beş kez 10 ila dördüncü konsantrasyonda 400 mikrolitre blokaj tamponu ekleyin ve peletin oda sıcaklığında 15 dakika beklemesine izin verin. 15 dakika sonra, hücre süspansiyonunu daha önce açıklandığı gibi santrifüj edin, ardından ayrılmış peleti 100 mikrolitre 1X PBS içinde yeniden askıya alın.
Makalede açıklandığı gibi tüp başına 1:100 seyreltme oranında monoklonal floresan antikorun bir mikrolitresini ekleyin ve tüpü 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübasyon için yerleştirin. Kuluçkayı takiben, hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 100 mikrolitre 1X PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra, kırmızı ve FITC kanallarını kullanarak bir akış sitometresinde 10.000 hücreye kadar floroforları tespit edin.
Mikro taşıyıcıları hazırlamak için, mikrotaşıyıcıların 0.75 gramını, oda sıcaklığında en az üç saat boyunca gram başına 50 miligram konsantrasyonda 1X DPBS'de şişirin ve nemlendirin. Daha sonra, mikro taşıyıcıları beş dakika boyunca taze DPBS'de yıkamak için süpernatantı boşaltın. Ortamı, gram başına 50 miligram mikro taşıyıcıda taze 1X DPBS ile değiştirdikten sonra, mikrotaşıyıcıları, inç kare başına 15 pound'da 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayarak sterilize edin.
Ardından, süpernatanı boşaltmadan önce sterilize edilmiş mikro taşıyıcıların yerleşmesine izin verin. Kültür ortamındaki mikro taşıyıcıları, oda sıcaklığında gram başına 50 miligram mikro taşıyıcı konsantrasyonunda durulayın. Mikro taşıyıcılar yerleştiğinde, süpernatanı atın.
Perfüzyon biyoreaktörünü hazırlamak için, daha önce açıklandığı gibi otoklavlama yaparak biyoreaktörü sterilize edin. İşiniz bittiğinde, yedinci SF-MSC'lere 2,5 kez 10 tahsis etmek için SF-MSC'lerin sayısını ve GMP sınıfı MSC kültür ortamının 250 mililitresi ile perfüze edilmiş biyoreaktöre mikro taşıyıcıları sayın. Biyoreaktörü, dakikada 15 dönme hızında, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren bir inkübatöre yerleştirin.
Kültür ortamını her altı günde bir değiştirin. 14 gün sonra, daha fazla analiz için hücre kültürü süpernatantlarını ve mikro taşıyıcılarını toplayın. Hücre kültürü süpernatantını dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin ve hücresel kalıntıları atarken süpernatantı toplayın.
Dört santigrat derecede, daha büyük vezikülleri atmak ve peleti toplamak için süpernatantı 10 dakika boyunca 2.000 kez G'de ve daha sonra 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de sırayla santrifüj yapın. Peleti 40 mililitre PBS'de yeniden askıya aldıktan sonra, hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede 70 dakika boyunca 120.000 kez G'de santrifüj edin. Daha sonra, 500 mikrolitre PBS'de eksozom içeren toplanan peleti yeniden askıya alın.
Yeni izole edilmiş eksozom örneklerini steril PBS ile mililitre başına 10 ila yedinci ila 10 ila dokuzuncu partikül konsantrasyonuna kadar seyreltin ve nanopartikül izleme analizine veya NTA sistemine dakikada 30 mikrolitre ve 24.4 ila 24.5 santigrat derecede her çalışma için numunenin 500 mikrolitresini enjekte edin. Yakalama ve analiz sistemini üreticinin protokolüne göre manuel olarak ayarlayın. Lazer ışık saçılmasıyla parçacıkları görselleştirin ve dijital videoda Brownian hareketlerini yakalayın.
Ardından, yazılım kullanarak kaydedilen video kasetleri analiz edin ve çalışma başına en az 200 ayrı parçacığı izleyin. Batı lekelemesi için, yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırarak eksozomlara 300 mikrolitre lizis tamponu ve proteaz inhibitörleri kokteyli ekleyin. Ardından, 20 dakika boyunca buzun üzerinde durmasını bekleyin.
Karışımın dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9, 391 kez G'de santrifüjlenmesinden sonra, bir protein tahlil kiti kullanarak süpernatanttaki protein konsantrasyonunu ölçün. Testi takiben, numuneyi 100 dakika boyunca 100 santigrat derecede 100 mikrolitre 4X protein yükleme tamponu ile ısıtın. Daha sonra, 70 dakika boyunca 120 voltta jel elektroforezi ve dört santigrat derecede 60 dakika boyunca 100 voltta elektro-lekelenme ile çalışmak üzere mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda 15 mikrolitre protein yükleyin.
Kalneksin gibi eksozom olmayan spesifik belirteçleri ve CD9, CD63 ve CD81 gibi ekzomal biyobelirteçleri floresan Western lekeleme ile tespit edin. Çalışmada, SF-MSC'lerin yüzey belirteçlerini tanımlamak için akış sitometrisi kullanılmıştır. Akış sitometrisi analizi, kültürlenmiş SF-MSC'lerin CD34, CD45 ve HLA-DR için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 için pozitif olduğunu ve MSC'lerin tanımlama kriterlerini karşıladığını ortaya koymuştur.
Ters mikroskopi altında, SF-MSC'lerin mikrotaşıyıcılar üzerinde çoğaldığı fark edildi. SF-MSC, 3D kültürde altı günden itibaren 2D kültüre kıyasla daha hızlı çoğaldı. 2D ve 3D kültürün SF-MSC'lerinden gelen eksozomlar Batı lekelenmesi kullanılarak tanımlandı ve eksozomların CD63, CD9 ve CD81'i eksprese ederken kalneksin için negatif olduğu bulundu.
Nanosit analizi, 2D ve 3D eksozomların çapının yaklaşık 120 nanometre olduğunu gösterdi. İletim elektron mikroskobik analizi, kabaca küresel vezikülleri gösteren 2D ve 3D eksozomların morfolojisini ortaya çıkardı. NTA analizi kullanılarak, 30 ila 160 nanometre boyutundaki parçacıkların konsantrasyonu analiz edildi.
3D kültürden sonra, parçacık konsantrasyonu mililitre başına 4.0 kat 10 ila altı idi. Bununla birlikte, 2B kültüründen sonra, aynı büyüklükteki parçacıkların konsantrasyonu, mililitre başına altı ila 2.5 kat 10 idi. Ayrıca, 3D kültür, 2D kültürden daha fazla eksozom proteini üretti.
Temsili analiz, Dil-etiketli eksozomların birincil kondrositler tarafından içselleştirilmesini göstermektedir. Primer kondrositlere giren dil etiketli eksozomlar üç saatte bir zirve ile görülebilir. İn vitro dağıtım çalışması, eksozomların sülfo-siyanin3 etiketli mikroRNA-140'ı kondrositlere verebileceğini göstermiştir.
Hücrelerin kaplanması, biyoreaktörde reaksiyonun başlatılması ve süpernatantın bu protokoldeki en önemli adımlardır. 3D kültür, yapışkan hücrelerin büyük ölçekli kültürü için yaygın olarak kullanılır. Spin flex gibi diğer yöntemler de eksozomların büyük ölçekli üretimi için kullanılabilir.
Yöntemimiz eksozomların verimini arttırır, böylece MSC eksozom tabanlı preklinik uygulamayı mümkün kılar.
