Bu protokol, araştırmacının tek duyusal nöronların bozulmamış bir omurda kontrollü bir stimülasyona aktivitesini ve tepkisini izlemesini sağlar. Bu yama elektrofizyolojisi, bireysel nöronların artan aktivitesinden gerçek zamanlı olarak kayıt yapmanın hızlı ve doğrudan bir yoludur. Ve bu, çoğu optik görüntüleme tekniğinden daha düşük maliyetle daha iyi zaman çözünürlüğü ve hassasiyet sağlar.
Yanal çizgi saç hücreleri insan iç kulağınınkine homologdur. Yani bu teknik, insan sağırlığı ve işitme bozuklukları için geçerli olan saç hücresi devrelerinin özelliklerini ortaya çıkarmak için hazırlanmıştır. Elektrofizyoloji, görülmesi ve fiziksel olarak taklit edilmesi gereken ince motor becerileri kullanan bir zanaattır.
Metin yalnızca talimatlar yanlış yorumlama için çok fazla yer bırakır. Başlamak için, silikon elastomer alt kayıt kabı yapmak için Sylgard gibi kendi kendini karıştıran silikon elastomer ince bir tabaka bir kapak cam tabanlı doku kültürü çanak içine dağıtın. Diseksiyon pimleri yapmak için, bir DC güç kaynağı kullanarak 100 mililitrelik bir Etchant kabına beş volt negatif şarj sağlayın ve pozitif yüklü çıkışa bir tungsten teli takın.
Ucu keskin bir noktaya daralıp gidene kadar telin ucunu tekrar tekrar Etchant banyosuna batırın. Stereo mikroskop altında, düz kenarlı bir jiletle teli ucundan yaklaşık bir milimetre kesin. Bunu üç kez tekrarlayın, ardından ince forseps kullanarak kürlenmiş kayıt kabına pimler yerleştirin.
Kayıt elektrotları hazırlamak için, kutu filamentli bir mikropipette puller kullanarak borosilikat cam kılcal tüpleri çekin. Elektrot, arka lateral çizgiden afferent nöronları kaydetmek için kullanılacak bir konik ile 30 mikrometre çapında bir uluğa sahip olmalıdır. Ek bir borosilikat cam kılcal boru, daha küçük bir ila beş mikrometre uç çapına sahip bir çift elektrot içine çekin.
Her elinde bir elektrot tutarak, uçları kırmak için uçları yavaşça birbirine doğru çalıştırın. Bir mikroforge kullanarak, eğimli ucu pürüzsüz olana kadar parlatın. Son uç çapı 30 ila 50 mikrometre arasında olmalıdır.
Zebra balığı larvalarını hareketsiz hale getirmek ve pipet aktarmak için büyük bir uç kullanarak 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın. Çevredeki çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Larvaları yaklaşık beş dakika boyunca% 0.1 alfa-Bungarotoxin'in 10 mikrolitresinde daldırin.
Felçli larvaları hücre dışı çözelti ile 10 dakika yıkayın. Daha sonra, larvayı hücre dışı çözelti banyosundan silikon tabanlı kayıt kabına taşımak için bir transfer pipet kullanın. Stereo mikroskop altında, larvaları ince uçlu ön uçlarla bu silikon paspasın merkezinin üzerine, yanal tarafı vücudun ön ve arka uçları sola sağa doğru çalışırken hafifçe yerleştirin.
İnce uçlu tokalar kullanarak, kenar pimini, larvaların dorsal notochord'u aracılığıyla silikona doğrudan anüse ortogonal olarak yerleştirin. İkinci pimi kuyruğun ucuna yakın notochord'dan yerleştirin ve üçüncü pimi gaz mesanesinin notochord dorsalına yerleştirin. Pim kapsüle takarken hafif bir dönüş sağlarken dördüncü pimi otik veziklikten takın.
Hafif bir dönüş uygulandığında, afferent somata kümesini ortaya çıkarmak için klatrorum ve otik vezikül arasındaki dokuyu izleyin. Pim larvalarını DIC mikroskopunun sabit bir aşamasına 10 kat hedefin altına yerleştirin ve sol baş evre vektörüne paralel olarak kas bloklarının miyoseptal yarıklarını yönlendirin. Zemin telini banyo çözeltisine yerleştirin ve sol baş aşamasına bağlı olduğundan emin olun.
VR kayıt elektrodunu esnek bir jel yükleme pipet ucu kullanarak 30 mikrolitre hücre dışı çözelti ile doldurun ve sol baş sahne pipet tutucusuna yerleştirin. Büyütmeyi 40 kata çıkarın ve bir pnömatik dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basıncı uygularken kayıt pipetini bulaşık çözeltisine küçümseyin. Yarık VR elektrot ucu diyaframında ortalanana kadar elektrot ucunu iki miyomer ventral arasındaki bir mioseptum üzerinden yanal çizgiye getirin Uç diyaframının gecikme kenarı epitelle hafifçe temas edene kadar pipeti kütüğe diriltin.
İlk temastan sonra, öndeki kenarın temas etmesini ve bir conta oluşturabilmesini sağlamak için pipeti çapraz olarak manevra yap. Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç uygulayın ve tutun. Yama kelepçe yazılımında, VR sinyalini izlemek için araç çubuğundaki Oynat düğmesine tıklayın.
Wells stereotipli patlama sinyali dinamikleri ile motor nöron aktivitesi gözlendikten sonra VR kaydının sağlandığından emin olun. Farklı kayıt elektrotunun içini 30 mikrolitre hücre dışı çözelti ile doldurun ve sağ baş sahne pipet tutucusuna yerleştirin. Daha sonra pnömatik dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basıncı uygularken bulaşık çözeltisine küçümser.
Elektrot'u bulun ve elektrot ucunu numunenin üzerine getirin. Bir mikromanipülatör kullanarak, afferent elektrot ucunu klatronun üzerinde pozisyon tutana kadar küçümseyin. Büyütmeyi 40 kat daldırma için artırın ve arka lateral çizgi siniri ve klatromunun kesişimini bulun.
Elektrot ucunu afferent ganglionun üzerine getirin ve uç epitelle temas edene kadar pipetleri küçümseyin. Yavaşça, elektrot manevrası yaparak tüm uç çevresinin afferent ganglionla temas ettiğini belirtin. Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç uygulayın ve tutun.
Yama kelepçe yazılımında Oynat'a tıkladıktan sonra, ani artışlar kabaca her 100 ila 200 milisaniyede bir meydana geldiğinde, afferent nöronların tüm hücre gevşek yama kaydının elde edildiğinden emin olun. Afferent nöron ve motor nöron aktivitesi tespit edildikten sonra, her iki kanalda da eşzamanlı boşluksuz kayıtları yakalamak için tepe kelepçesi 10'daki araç çubuğundaki Kaydet düğmesine tıklayın. Metin taslağında açıklandığı gibi veri ön işleme gerçekleştirin.
Bu boşluksuz kayıt protokolü kullanılarak, afferent ve VR nöronlarının gerçek zamanlı etkinliği aynı anda ölçülebilir. Özel yazılı, ön işleme komut dosyaları, eşik, minimum süre ve minimum ara aralık gibi parametreleri kullanarak ani algılamanın görselleştirilmesine yardımcı olacak çizimler oluşturur. İzole sinyaller, ön işleme komut dosyasındaki alt ve üst sınır algılama değişkenleri ayarlanarak elde edildi.
Ventral kökler başak algılama ek girişler ile özdeş parametreleri izler. Bir motor komutundaki patlamalar, en az beş milisaniye süren 0,1 milisaniye içindeki en az iki ani artışla tanımlanır ve 200 milisaniyeden daha az patlama aralıklarıyla en az üç patlama ile tanımlanır Ön işleme komut dosyaları, iyi tanımlanmış bir ilgi süresine girilen farklı etkinliğin bölümlerini kaplar. Bu durumda, ortalama spontan aktivite, X ekseninde sıfıra eşit zaman olarak gösterilen motor aktivitenin başlangıcına yanıt olarak çarpıcı değişiklikler gösterir.
Yüzme öncesi ani artış oranları ile hem yüzme hem de yüzme sonrası dönemlerin ani artış oranları arasında belirgin ani artış oranlarında anlamlı farklılıklar saptandı. Afferent ani artış oranları yüzme süresi ile negatif korelasyona uğramıştır. Göreceli yükselme hızı ve yüzme sıklığı arasında korelasyon saptanmamıştır.
Bu prosedürü denerken hayvan sağlığı en önemli şeydir. Sadece hayvan refahını sağlamak için değil, aynı zamanda sinirsel kayıt başarısının olasılığını artırmak için hızlı kan akışını izlemek çok önemlidir. Zebra balığında bulunan genetik araçlardan yararlanarak, bu elektrofizyoloji protokolü, saç hücresi sistemlerinde ve ötesinde anatomik ve fonksiyonel devre bağlantısını güçlü bir şekilde araştırmak için transgenik çizgiler tarafından tamamlanabilir.
Yama kelepçe tekniğinin bu basitleştirilmiş modifikasyonu, duyusal sistemlerin in vivo olarak nasıl çalıştığını izlememizi sağlar.
