Bu yöntem, işitme ve denge alanındaki temel soruların yanıtlenmesine yardımcı olabilir. Bu duyusal saç hücrelerinin fonksiyonu, mekanotransdüksiyon ve presinaptik aktivitenin iki önemli yönlerini tespit nasıl açıklar. Bu tekniğin en önemli avantajları, canlı bir hayvandaki saç hücrelerinin işlevini görselleştirmemize ve saç hücrelerinin koleksiyonlarının duyusal bilgileri nasıl algılayıp iletmemizi araştırmamıza olanak sağlamasıdır.
Bu prosedürü başlatmak için, sertleştirilmiş kapsül üzerinde, baş ve kuyruk yoluyla larva immobilize etmek için kullanılacak pimleri moda ince forceps ve tungsten tel kullanın. Baş iğneleri yapmak için, bir elinde 0.035 milimetre tungsten tel bir parça tutun. Diğer taraftan ince forseps kullanarak, teli bir milimetre yukarı doğru bükün, 90 derecede.
İnce makas için forseps değiştirin ve pin oluşturmak için, viraj sonra bir milimetre kesti. Daha sonra pimleri odanın sertleştirilmiş kapsüllerine yerleştirmek için forceps kullanın. Larvayı perfüzyon odasının ortasına yerleştirin, böylece yan tarafında silikon kapsüle karşı düz bir şekilde durun.
İnce pratisyenler kullanarak, 0.035 milimetrelik baş pinini larvaya dik olarak indirin. Göz ve otik vezikül arasına baş iğnesi yerleştirin ve aşağı kapsül içine. Sabitleme sırasında, dorsal ve ventral tarafı boyunca larva stabilize etmek için ikinci bir forceps kümesi kullanın.
Pinin yatay kısmının larvayla temas ettiğinden ve kapsüle kadar bastırmadığından emin olun. Sonraki kalp enjeksiyonu ve saç hücresi görüntülemesine müdahale etmekten kaçınmak için iğne yiventiyetine veya larvanın ön örcürünün biraz namına hafifçe işaret ederek iğneyi sapta. Forceps kullanarak, notochord içine 0.025 milimetrelik kuyruk pimi takın, kuyruk sonuna mümkün olduğunca yakın.
Larva içine alfa bungarotoksin enjekte etmek için, bir jel yükleme pipet ucu kullanarak, enjeksiyon iğneiçine çözeltinin üç mikrolitre backfill. Çözeltiyi kabarcıksız olarak ucuna eşit olarak yükleyin. Sonra manuel bir mikromanipülatör bağlı bir pipet tutucu içine kalp enjeksiyon iğnesi takın.
Stereo mikroskop altında, iğneyi anestezi kırvasının AP eksenine dik olarak hizalanmış şekilde konumlandırın ve 30 derecelik bir açıyla aşağı doğru işaret edin. Daha sonra pipet tutucuyu basınç enjektörüne bağlayın. İğne ucunun açık olup olmadığını test etmek için çözeltiye bir bolus alfa bungarotoksin enjekte edin.
Kırmızı renk görülmezse, iğne ucunu bir pimin kenarına nazikçe kazıyın ve iğne temizlenene kadar tekrar deneyin. Daha sonra, kalp dışında deri dokunur kadar, kalbe doğru iğne ilerlemek. İğneyi larvaya bastırın ve iğnenin larvaya göre doğru düzlemde konumlandırDığından emin olmak için kalbin önündeki derideki pigment hücresinin girintisini arayın.
Sonra, iğneyi daha uzağa ilerletin, ta ki deriyi delip kalp boşluğuna girene kadar. İğneyi hafifçe geri çekin ve kalp boşluğuna bir bolus alfa bungarotoxin enjekte edin. Kalp boşluğunda şişme ya da kaviteye giren kırmızı boya için bak.
Yavaşça larva üç kez durulayın, nöronal tampon bir mililitre ile kalan MS222 kaldırmak için. Sıvının tamamını asla çıkarmayın. Perfüzyon odasında nöronal tampon yaklaşık 1 milileter larva korumak.
Bu işlemde, jel yükleme ucu kullanarak düzgün kırık bir sıvı-jet iğneiçine neronal tampon 10 mikrolitre backfill. Çözeltiyi kabarcıklar olmadan ucuna eşit olarak yükleyin. Daha sonra, motorlu mikromanipülatöre bağlı pipet tutucuya iğneyi takın.
Perfüzyon odasını mikroskop aşamasında dairesel bir oda adaptörüne yerleştirin. Motorlu sahneyi larva görüş alanının merkezinde olacak şekilde hareket ettirin. Daha sonra, dairesel oda adaptörünün larvaya AP erişiminin akışkan-jet iğnesinin yörüngesiyle kabaca aynı hizaya dönmesi için çevirin.
İletilen ışık ve diferansiyel girişim kontrastını kullanarak larvayı odak noktası haline getirin ve 10x hedefi nin altına odaklandırın. Sonra, 10x hedefi yükseltmek. Motorlu mikromanipülatör kullanarak, görüş alanının merkezine sıvı-jet iğne aşağı getirmek, böylece iletilen ışık ile aydınlatılır ve ancak nöronal tampon dokunmadan.
Konumunu doğrulamak için larva odaklanmak için 10x hedefi düşürün. Akışkan jet iğnesi üzerindeki hedefi belirsiz. Sıvı-jet iğnesini x ve y eksenindeki mikromanipülatörle larvanın dorsal tarafına paralel bir konuma gelene kadar hareket ettirin.
Daha sonra larvaya odaklan. İğneyi z eksenine getirin ve iğneyi vücuttan 1 milimetre uzakta, balığın sırt tarafı boyunca konumlandırın. Sıvı jet iğnesi larva AP orta hattı boyunca hizalanmış olduğundan emin olmak için dairesel oda adaptörü dikkatle hareket ettirin.
Daha sonra, 60x su hedefine geçin. Amaç nöronal tampon emersed olduğundan emin olun. Bir nöromast bulmak için ince odak kullanın.
Daha sonra görüş alanının merkezine ilgi nöromast yerleştirmek için motarize sahne hareket ettirin. Balık sırt tarafı boyunca sıvı jet iğne ucu tutun. Sıvı püskürtmeli iğne ucuna larva ya da oda yüzeyine dokunmayın.
Akışkan-jet iğnesini mikromanipülatörle yerleştirin, böylece nöromastın dış kenarından 100 mikrometre uzakta dır. Sonra, apikal saç demetleri ipuçlarına kadar odaklanın. Sıvı-jet iğnesinin alt kısmı bu düzlemde odaknoktası olmalıdır.
Görüntüleme yazılımından giriş almak için manuelden harici moda yüksek hızlı basınç kıskacını ayarlayın. Sıfır düğmesine basarak yüksek hızlı basınç kıskacını sıfırla ve dinlenme basıncını biraz pozitif ayarlamak için ayar noktası düğmesini kullanın. Yüksek hızlı basınç kıskacının dinlenme çıkışını, baş sahne çıkışına bağlı bir PSI manometre kullanarak doğrulayın.
Saç demetlerini uyarmak için gerekli basıncı belirlemek için, 200-500 milisaniye için 0,125 ve 0,25 volt çıkış ile bir test uyarıcı uygulayın. Her test uyarıcı için, saç demetleri, kinocilia ipuçları sapma mesafesini ölçmek. Demetleri yaklaşık 5 mikrometre lik bir mesafeye hareket ettiren bir basınç seçin.
Kinocilia ipuçları odak tüm zaman kalır emin olun. Tek düzlemli görüntüler elde etmek için, 80 kare kazanımı sırasında, 30 saniye kare sonra teslim etmek için bir uyarıcı seçin. Mekanoduyark kalsiyum tepkilerini ölçmek için, apikal saç demetlerinin tabanına odaklanın ve görüntü edinimini başlatın.
Presinaptik kalsiyum yanıtlarını ölçmek için, saç hücrelerinin tabanına odaklanın ve görüntü edinimini başlatın. Simülasyon sırasında bir nöromast içinde GCaMP6S yoğunluğundaki spatiotemporal değişiklikleri görselleştirmek için adımlar burada özetlenmiştir. Zaman, zaman damgasına göre soldan sağa doğru temsil edilir.
Üst satır, 70 karelik GCaMP6S F görüntü dizisinden on dört zamansal kutudan beşini gösterir. İkinci satırda, delta F görüntüleri oluşturmak için her GCaMP6S F binned görüntüden taban çizgisi kaldırılmıştır. Üçüncü satırda, delta F görüntüleri gri ölçekten kırmızı sıcak arama tablosuna dönüştürülür.
Alt satırda, üçüncü satır üst satırdaki F görüntülerine üst üste bökezlemiştir. Bu yordamı denerken, larvanın doğru sabitlenmiş olduğundan emin olmak ve makalede açıklandığı gibi hareket yapılarını verilerinizden hariç tutmak için uygun denetimleri kullanmak önemlidir. Alfa bungarotoksin ile çalışmak tehlikeli olabilir.
Bu tür taşıma sırasında eldiven giymek gibi önlemler almak önemlidir.
