Endolenfatik kese, iç kulağın normal gelişimi için gereklidir. Yapısal, fizyolojik ve moleküler çalışmalar için yerinde erişilemediğinden, hayvan modellerinden, özellikle fare modellerinden diseksiyonu esastır. Endolenfatik kesenin diseksiyonu ve hazırlanması, ince, narin epitel yapısı, komşu dokulara yakınlığı ve adezyonu nedeniyle son derece zordur.
Yaklaşımımız, bir kesenin görselleştirilmesini ve tanımlanmasını ve bitişik dokulardan ayrılmasını kolaylaştırır. Endolenfatik kesenin normal işlevini etkileyen hastalıklar ve bozukluklar işitme ve denge kaybına yol açabilir. Tekniğimiz, endolenfatik kese fonksiyonlarının altında yatan hücresel, moleküler ve fizyolojik süreçleri aydınlatmak için gereklidir.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora sonrası misafir araştırmacı olan Hyun Jae Lee olacak. İç kulak hazırlığını, sekizinci kraniyal sinirin kökü yukarı bakacak şekilde PBS içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü kabında düzenlemekle başlayın. No.4 forseps kullanarak, dokuyu kokleada tutun ve vestibüler su kemerini, ön ve arka yarı dairesel kanalları, ortak crus'u ve sigmoid sinüsü tanımlayın.
Ardından, dura mater ve vestibüler su kemerinin yanı sıra endolenfatik kesesi çevreleyen alttaki bağ dokularını kesmek için bir mililitrelik şırınga üzerine monte edilmiş 27 gauge bir iğne kullanın. Endolenfatik kesenin lateral bağ dokusuna bir kesi yaptıktan sonra, bağ dokusunu tutmak için forseps kullanın ve temporal kemikten çekerek soyun. Kalan kalıntıları dikkatlice temizleyin ve endolenfatik kese epitelini çevre dokulardan ayırın.
Açılan endolenfatik kesenin diseksiyonu için, lümenin enine kesitini gözlemlemek için preparatın gövde kısmını tutun. Ardından lümene 27 gauge bir iğne sokun ve endolenfatik kesesi iki tabaka halinde kesmek için hareket ettirin. Her tabaka benzeri dokunun kenarını forseps ile tutun ve birbirinden ayırın.
Temsili analizde, bu farelerin kafatasının yarısının beyin çıkarılmasından önce ve sonra orta sagital bir bölümü tdTomato floresansı ile görselleştirildi. Endolenfatik kese, diseksiyon yapılmasa bile kolayca görülebiliyordu. Embriyonik gün 16.6'da ve doğum sonrası 5. ve 30. günlerde farelerin iç kulakları izole edildi.
Endolenfatik keseler daha yüksek büyütme altında gözlendi. P30 fareleri için, kemikte kapsüllenmesi nedeniyle endolenfatik kanalın izole edilmesi zordur. E16.5 ve P5'ten gelen sağlam endolenfatik keselerin immünohistokimyası, anti-SLC26A4 antikor ve phalloidin etiketlemesi ile çalışıldı.
Falloidin, endolenfatik kese ve etrafındaki konjonktiv dokuyu vurgulamak için kullanıldı. P5'te açılmış endolenfatik kese epitelinin yüksek büyütme görüntüleri, yeşil ile işaretlenmiş SLC26A4 bir hücre alt kümesinin apikal bölgesinde lokalize olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, endolenfatik keseye zarar vermemek için çok nazik olmaktır.
Bu yaklaşımla izole edilen sabit bir endolenfatik kese dokusu, in situ hibridizasyon, RNA kapsamı ve immünohistokimya için kullanılabilir. Canlı doku, transkriptom analizi ve fizyoloji için RNA'yı hazırlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşım, farklı hücre tiplerinin karakterize edilmesine katkıda bulunmak için endolenfatik kesenin transkriptomunu bir bütün olarak veya tek hücreli RNA-seq analizinde incelemek için kullanılmıştır.
