Bu protokol, pankreasın stabilize ve tekrarlayan hücresel düzeyde in vivo görüntülemesini yeni bir pankreas intravital görüntüleme penceresi ile açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, canlı bir farenin pankreasında üç hafta boyunca hücresel seviyeye kadar çözünürlükle hareketsiz, üç boyutlu görüntülemenin yapılanın mümkün olmasıdır. Cerrahi platformu hazırlayarak ve yüzeyleri % 70 etanol ile dezenfekte ederek başlayın.
Anesteziden sonra, vücut sıcaklığını izlemek için homeotermik kontrollü bir ısıtma yastığı ile bir rektal prob kullanın. Farenin sol kanadından saçları çıkarın ve alternatif olarak alkol ve iyot uygulayın, kesi bölgesinden dış yüzeye döner, asla kesi bölgesine geri dönmez ve iyotla sona erer. Ardından, farenin sol kanadında cildi ve kası keserek 1,5 santimetrelik bir kesi yapın.
Kesi kenar boşluğunda bir çanta dize dikişi gerçekleştirmek için siyah veya naylon 4-0 dikiş kullanın. Dalağını halka tokparlamaları ile dikkatlice çekin ve pankreası tanımlayın. Pencereyi farenin kanadına yerleştirerek, dalak ve pankreası pencerenin açık alanından geçirin.
Daha sonra, dalağını pencerenin açık alanına yerleştirirken pankreası yavaşça görüntüleme penceresinin plakasına yerleştirin. PANC-1 nüklit kırmızısını doğrudan pankreasa enjekte edin. Görüntüleme penceresinin kenar boşluğuna n-Butyl siyanoakrilat tutkal damlaları uygulamak için 31 kalibrelik bir kateter iğnesi kullanın ve minimum miktarda tutkal uygulanmasını sağlayın.
Görüntüleme penceresinin kenar boşluğuna hafifçe 12 milimetrelik yuvarlak bir kapak camı uygulayın. Ardından, pencerenin yanal oluğuna sığacak şekilde dikiş halkasını tutun ve üç kez bağlayın. Son olarak, fareler uyanıkken bu sıkı dikişlerin kesilmesini önlemek için kravatın maksimum proksimal bölgesini kesin.
Lazer gücü de dahil olmak üzere intravital mikroskobu açarak başlayın. Vasküler kateter takmak için, kuyruğun proksimal tarafına işaret ve üçüncü parmakla basınç uygulayın. Gerekirse kuyruğu bir lamba ile ısıtın.
Kuyruk damarını% 70 etanol spreyi ile dezenfekte edin, ardından yanal kuyruk damarına 30-gauge bir kateter yerleştirin ve PE-10 tüpündeki kanın kusmasını görselleştirin. Stabilize etmek için katetere ipek bant uygulayın. Floresan probların kombinasyonuna göre FITC dektran ve TMR dektran veya diğer floresan probları uygun şekilde enjekte edin.
Homeotermik ısıtma yastığı sistemi ile vücut sıcaklığını otomatik olarak kontrol etmek için bir rektal prob takın. Ardından intravital mikroskopi kurulumu sırasında hazırlanan pankreas görüntüleme penceresini pencere tutucusuna yerleştirin. Fareyi cerrahi platformdan görüntüleme aşamasına aktarın.
İntravital görüntüleme yapmak için pankreasın pankreası, pankreasın tüm görünümünü pankreas görüntüleme penceresinde taramak için dört kez gibi düşük bir büyütmede görüntüleme ile başlayın. İlgi alanı belirlendikten sonra, sırasıyla yaklaşık 0,5 mikrometre ve 3 mikrometre yanal ve eksenel çözünürlükte hücresel düzeyde görüntüleme yapmak için 20 kez veya 40 kez daha yüksek bir büyütme objektif lensine geçin. 3D yapıyı veya hücre geçişi gibi hücre düzeyindeki dinamikleri gözlemlemek için Z yığını veya hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.
Pankreas intravital görüntüleme penceresi ile birlikte intravital mikroskopi, tek tek adacıkları üç haftaya kadar izlemek için yüksek çözünürlüklü görüntülemenin edinilmesini sağlayan uzun süreli doku stabilitesi sağlar. Damardan enjekte edilen anti-CD31 antikorlu C57 siyah 6 N fareye yerleştirilen pencere, Alexa 647 floroforu ile konjuge edildi, geniş alan görüntülemesini kolaylaştırdı ve pankreasın 3D görüntülemesini büyüttü. Acinar hücreleri, sırasıyla otofluoresans ve anti-CD31 antikoru kullanılarak görselleştirilen bitişik vaskültürdeki pankreas dokusunun ortalama görüntülerinde tanımlanmıştır.
Geniş alan görünümünü yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birleştiren mozaik görüntüleme yöntemi kullanılarak, mip-GFP faresinde bitişik vaskülat ile yaklaşık 40 ila 50 adacık görselleştirildi. Daha önceki bir çalışma, adacıkların bu kararlı görüntüleme yöntemi kullanılarak üç haftaya kadar izlenebileceğini göstermiştir. Kanser hücrelerini görselleştirmek için, PANC-1 nüklit kırmızı hücreleri ameliyat sırasında doğrudan fare pankreasına yerleştirildi ve yakındaki damarlar Alexa 647 ile konjuge anti-CD31 ile boyandı.
Bu protokol kullanılarak pankreas kanserinin geniş alan görüntüleri oluşturulmuştur. Bu, tümörün kenar boşluğunun tanımlamasına ve tek hücre düzeyinde yüksek çözünürlüklü 3D görüntüler elde etmeye yardımcı oldu. Bu yöntemdeki en kritik adım, pankreas görüntüleme penceresinin fareye ustaca yerleştirilmesidir.
Floresan fare hücrelerinin ve antikor problarının diğer kombinasyonları kullanılarak, yakındaki hücrelerin adacıklarla dinamik etkileşimi veya hücreleri iptal etmek tanımlanabilir. Bu yöntem, çeşitli patofizyolojik koşullarda ve pankreas kanseri in situ mikro ortamlarında adacığın değişimini araştıranlar tarafından yaygın olarak uygulanabilir.
