Bu video, karaciğer doku biyolojisi deneysel bir ex vivo modeli olarak hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretimi ve uygulama göstermektedir. Hassas kesilmiş karaciğer dilimleri in vivo hayvan çalışmaları ve in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında var olan deneysel bir niş işgal. Bu teknik in vivo hayvan çalışmaları üzerinde çeşitli önemli faydaları vardır, aynı karaciğerden kontrol ve tedavi örnekleri kullanma yeteneği de dahil olmak üzere, diğer organ sistemlerinden hedef dışı etkileri kaldırmak için karaciğer dokusunun izolasyon, ve bütün bir canlı fare uygulandığında olumsuz bir etkisi olabilir reaktifler kullanma yeteneği, örneğin, toksik yol inhibitörleri.
Bu teknik, laboratuvar doku kültürünütakip eden canlı karaciğer dokusunun ultra ince, karaciğer dilimlerini kesmek için yanal titreşen bir bıçak kullanmayı içerir. Bıçağın titreşimleri kesme geriliminin neden olduğu yırtılmayı önler. Bu örnekte, canlı ex vivo karaciğer dilimlerinin hazırlıkları için teknikler göstereceğiz, ve bu ex vivo doku karaciğer fibrogenez mekanizmaları değerlendirmek için kolestatik karaciğer hasarı uyarmak için safra asitleri ile tedavi edilir örnek deneylerde karaciğer dilim kültürünün yarar göstermek.
Bıçağı kesme koluna takın. Bıçağı ve kesme kolunu %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin. Bıçakla temastan kaçınmak için her zaman dikkatli olun.
Tampon tepsiyi %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin ve steril bir dokuile silin. Tampon tepsiyi vibratome takın ve montaj vidasını sıkın. Kesme kolunu mevcut maksimum yüksekliğe ayarlayın.
Bıçak açısını kontrol et. Vibratomemizde, yataydan 10 derecelik bir açı kullanırız, bıçak numuneye doğru eğimlidir. Bıçak açısının sıkıca sabitolduğundan emin olun.
Numune tutucuyu yine %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin. Tampon tepsinin altında bulunan Peltier termoelektrik soğutucunun soğutma suyunu bağlayın. Bazı vibratom modelleri yerine soğutma için bir buz banyosu kullanın.
Su boruyu bir kanalizasyona sabitleyin ve suyu açın. Soğutucuyu 4 dereceye ayarlayın. Tampon tepsisine buz gibi Krebs-Henseleit tampon ekleyin.
Tüm cerrahi aletler ve malzemeler steril olmalıdır. Fareler derinden anestezi veya ötenazi olmalıdır. Farelerin deri yüzeyleri %70 etanol çözeltisi ile ıslatılarak dezenfekte edildi.
Karın boşluğutabanından diyaframa kadar cilde orta hat kesisi yapın. Temiz forceps ve makas kullanarak, karın boşluğu açın. Loblar zarar vermeden, hızlı bir şekilde karaciğer çıkarın.
Aşağı karaciğer itin ve karaciğerin üst kısmında bağ dokusu kesti. Karaciğeri yukarı doğru itin. Forceps ile karaciğerin merkezi vasküler alanı tutun ve yukarı çekin.
Bağ dokusu kan damarlarını kesin. Karaciğer lobları zarar değil dikkat edin, ve ayrıca, gastrointestinal sistem içine kesmek için değil dikkat edin. Buz gibi Krebs-Henseleit tampon steril bir çanak içine kaldırılan karaciğer yerleştirin.
Karaciğeri tek tek loblara ayırın. Bir karaciğer lob seçin ve yeni bir steril çanak aşağı düz tarafı yerleştirin. Krebs-Henseleit tampon diğer loblar buz üzerinde tutun.
Karaciğer loblarının kenarlarını kırpın. Kesme, özellikle kesme bıçağına temas edecek kenarda, kesme bıçağına nispeten dik bir doku kenarına sahip olmanın sığ açılarda oluşabilecek doku sıkıştırmasını önleyeceği için önemlidir. Diğer üç kenarları etrafında doku kesme doku kenarında fibröz kapsülçok kaldırır, ve genellikle doku dilimleri daha kolay kaldırılmasını sağlar.
Numune tutucunun ön kenarına ince bir siyanoakrilat tutkalı tabakası yerleştirin, kesilmiş karaciğer loblarından biraz daha büyük. Steril emici malzeme kullanarak dokudan tampon herhangi bir kalıntı çıkarın. En büyük kenarı öne bakacak şekilde, siyanoakrilat tutkal üzerine karaciğer lobu yerleştirin.
Bir ila iki dakika havada tedavi etmek için izin verin. Numune tutucuya bağlı olan dokuyu vibratome yerleştirin. Vibratom hızını ayarlayın.
Kesme bıçağını karaciğer lobunun hemen üstünde bulunana kadar indirin. Titreşen kesme kolunu numunenin üzerine çalıştırın. Bu makinedeki bıçağın titreşimi ayak pedalı ile aktive edilir.
Bıçağı geriye doğru döndürün ve bıçak yüksekliğini 250 mikrometre düşürün. Bu işlemi, dokunun üst tabakası çıkarılana kadar tekrarlayın. Bu Glisson kapsüliçerecek gibi ilk bir veya iki dilim atın, ve bu nedenle, çok fonksiyonel karaciğer dokusu içermez.
Karaciğer dilimlerini kesmek için, titreşen bıçağı sapı çevirerek yavaşça dokuya doğru ilerletin. Kesme işlemi sırasında dokuyu nazikçe yönlendirmek için küçük bir fırça kullanın. Kesilmiş doku bölümünü almak için paintbrush kullanın ve sonra depolama için Krebs-Henseleit tampon içeren steril bir tüp içine doku bölümü yerleştirin.
Kullanılmadığı zaman, bu tüpü buzda tutun. Bazen, doku kesme işlemi sırasında gözyaşı yok, ama çoğu amaç için, doku hala kullanılabilir. Sikoakrilat tutkal yakın kadar doku dilimleri kesin.
Tutkalkesme. Gerekli sayıda doku dilimi elde edilene kadar buz üzerinde duran diğer karaciğer lobları ile tekrarlayın. Numune tutucuyu temizlemek için, tutkal-doku karışımını kazımak için bir bıçak kullanın veya karışım aseton veya dimetil sülfoksit gibi çözücüler kullanılarak yumuşatılabilir.
Bir doku kültürü başlık, pipet 12-iyi plaka içine% 10 fetal sığır serum ve antimikrobiyaller içeren Williams'E orta bir mL. Yavaşça steril bir çanak içine karışımı ve ucu girdap doku dilimleri çıkarın. Dokuyu kabaca düzgün bir boyuta kesin.
Bu örnekte, yaklaşık 50 milimetre karelik bir yüzey alanına sahip doku dilimlerini hedefledik. Tutarlılık için doku dilimleri incelemek için özen. Koyu dilimler doku kalınlığının arttığını ve atılması gerektiğini düşündürür.
Daha hafif dilimler kürlenmiş siyanoakrilat tutkal varlığını öneririz, ve atılmalıdır. Doku dilimlerini bir mililitre ortam içeren 12 kuyulu tabağa aktarın. Normal doku kültürü koşulları altında karaciğer dilimleri kuluçka.
Mümkünse, doku dilimleri için oksijen kullanılabilirliğini artırmak için yöntemler kullanın. Ertesi gün, emme ile doku kaybını önlemek için manuel pipet kullanarak ortamı değiştirin. Hassas kesimli karaciğer dilimleri artık deneysel kullanıma hazır.
Uygulamamız için karaciğer dilimlerini iki gün boyunca safra asitleri ile tedavi ettik ve kurye RNA ekstraksiyonu ve qPCR analizi için lysis tamponunda homojenize edildik. Zaman içinde hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin canlılığını incelemek için, hücre canlılığı için bir proxy olarak ATP düzeylerini kullandık. ATP düzeyleri proteine normalleştirildi ve izolasyon sonrası birden fazla zaman noktasında ölçüldü.
Ani ve bir saatlik numunelerde ATP düzeyleri düşürüldü, ancak bu durum üç saat içinde kurtarıldı. Bunu takiben, ATP seviyeleri beş gün boyunca korundu, ancak zaman içinde düşüş eğilimi ni kaydettiler. H&E boyama, kültürde beş güne kadar tutulan hassas kesimli karaciğer dilimlerini incelemek için kullanıldı.
Doku morfolojisi ikinci günde meydana gelen bazı nekrozları düşündürüyor, ve şiddetli nekroz beşinci güne kadar oluyor. İkinci ve beşinci günler arasında meydana gelen nekroz nedeniyle, bu tekniğin deneysel faydasının yaklaşık üç gün le sınırlı olmasını öneririz. Ancak, bu doku dilimleri için daha iyi oksijen dağıtım teknikleri kullanılarak geliştirilmiş olabilir.
Hassas kesilmiş karaciğer dilimleri de kültürde zamana göre kollajen liflerin kalınlaşma var gibi görünüyor. Bu, spontan fibrojenik süreçlerin meydana olduğunu düşündürmektedir. Örnek deneyde, hassas kesilmiş karaciğer dilimleri hepatik kolestaz taklit etmek için, iki gün boyunca üç ayrı safra asitleri ile tedavi edildi.
Üç kolanjiyosit özgü genlerin mRNA ekspresyonuna bakıldığında, iki konjuge safra asitleri, glikolik ve taurokolik asitler, hem sitokeratin-19 hem de connexin-43 ekspresyonunu önemli ölçüde artırmıştır. Bu kolanjiyosit gelişimi ile uyumludur. Bu videoyu izledikten sonra, hassas kesilmiş karaciğer dilimleri oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır, ve nasıl temel doku kültürü gerçekleştirmek için.
Hassas kesilmiş karaciğer dilimleri rna ekspresyonu, protein ekspresyonu, epigenetik, DNA bağlama, metabolizma, enfeksiyon mekanizmaları, kanser istilası, farmakoloji, hücre biyolojisi ve salgı çalışmaları deneysel araştırmalar da dahil olmak üzere çok geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir, sadece birkaç isim.
