Üç boyutlu kök hücre kaynaklı insan kalp kasının invitro modelimiz, laboratuvar hayvanı testleriyle ilişkili türler arası farklılıkları ortadan kaldırırken, geleneksel iki boyutlu hücre kültürünün biyolojik doğruluğunu geliştirir. Stabil post izleyicilere sahip çok dokulu biyoreaktör tasarımımız, doku başarısını en üst düzeye çıkarır ve tasarlanmış kalp dokusu fonksiyonunun derinlemesine karakterizasyonunun doğruluğunu artırır. Kalp yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olmaya devam ederken, tasarlanmış kalp dokularımız araştırmacıların insan kalp hastalıklarını modellemesine ve potansiyel tedavileri taramasına olanak tanır.
Başlamak için, direk delikleri üçgen rafların karşısındaki ölü alanla aynı hizaya gelecek şekilde döküm tutucuya dört alüminyum negatif ana döküm yerleştirin. Cihazı iki paralel braket arasına yerleştirin ve cl sıvı PDMS'nin sızmasını önlemek için conta olarak 0,5 milimetre kalınlığında silikon kaplamadan oluşan dikdörtgen bir parça kullanarak kenarları birbirine bağlayın. Sığ bir kapta, 0,5 mililitre PDMS sertleştirme maddesini beş mililitre PDMS elastomer tabanı ile bire 10 oranında karıştırın ve beş dakika kuvvetlice karıştırın.
PDMS karışımını, kabarcıklar kaybolana kadar güçlü bir vakum altında bir vakum odasında gazını alın. Ardından, PDMS karışımını döküm aparatına dökün ve her bir yuvanın tam olarak kaplanmasını sağlamak için aşırı doldurun. PDMS raflarının gövdesine, her bir rafın benzersiz bir şekilde tanımlanması için direklerin karşısındaki tarafa küçük renkli cam boncuklar ekleyin.
Yatay olarak tesviye edilmiş döküm aparatını en az 12 saat boyunca güçlü bir vakum altında vakum odasına yerleştirin. Hassas direklerin tam kürlenmesini ve maksimum mukavemetini sağlamak için PDMS'nin oda sıcaklığında 48 saat boyunca tozdan uzakta kürlenmesine izin verin. cl'yi çıkarınamp, braketler ve silikon kaplama döküm aparatından.
Paslanmaz çelik bir tıraş bıçağı kullanarak, döküm aparatının ve çerçeve desteklerinin üstündeki PDMS filmini kesin. PDMS raflarını döküm tutucunun kenarlarından ayırmak için parmaklarınızı kullanın. Döküm ile döküm tutucu arasındaki ölü boşluğa körelmiş bir paslanmaz çelik tıraş bıçağı sokun ve ölü alanı dolduran PDMS'nin döküm tutucuda kalmasını sağlayarak bunları kaldırın.
Ardından, keskin bir paslanmaz çelik bıçak kullanarak, kalan PDMS filmlerini ve ölü boşluk PDMS'yi direklerin uçlarından kesin. Parmaklarınızı kullanarak, PDMS rafını direklerin karşısındaki taraftaki kalıptan yavaşça ayırın. Direkler ana dökümlerden kurtulana kadar taraf değiştirmeye devam edin.
Daha önce gösterildiği gibi tüm PDMS raflarını ve direklerini serbest bırakın ve raflarda kalan fazla PDMS'yi kesmek için keskin bir tıraş bıçağı kullanın. Termoplastik kaynaşmış biriktirme modelleme 3D yazıcı kullanarak, sabit post tracker veya SPoT döküm aparatının bileşenlerini yazdırın. 3D baskılı parçalar arasında ve PDMS rafları ile üç uçlu aparat arasında güvenli bir pres oturduğundan emin olun.
Ayrıca, PDMS raflarının, direklerin bükülmeden kuyuların dibine ulaşmasıyla sıkıca oturduğunu onaylayın. 0,5 mililitre siyah PDMS A kısmı ile 0,5 mililitre B kısmını küçük bir tartı teknesinde veya sığ bir kapta, çözeltinin rengi homojen olana kadar karıştırın. Karışık siyah PDMS'yi bir vakum odasında 20 dakika boyunca güçlü bir vakum altında gazdan arındırın.
Delikleri doldurmak için gazı alınmış siyah PDMS'yi 3D baskılı tabana dökün ve kabarcık kalmadığından emin olmak için hafifçe vurun. Tabandan mümkün olduğunca fazla PDMS'yi kazıyın. Üç uçlu parçayı tabana oturtun ve PDMS raflarını üç uçlu jig üzerindeki oluklara yerleştirin, böylece direklerin uçlarının dairesel kuyulardaki siyah PDMS'ye dalmasını sağlayın.
Siyah PDMS'nin oda sıcaklığında 48 saat tozdan uzakta kürlenmesine izin verin. Direklerdeki gerilimi en aza indirerek üç uçlu parçayı dışarı kaydırın. Küçük forseps kullanarak, her bir SPoT'yi çevreleyen ince siyah PDMS filmini kazıyın, ardından 3D baskılı tabandan kurtarmak için ince uçlu, bükülmüş forsepsleri SPoT kuyusuna yerleştirin.
SPoT'leri inceleyin ve ince vannas makası kullanarak döküm işleminden kalan siyah PDMS filmini kesin. PDMS raflarını polys cep telefonu çerçevesine takarak ve ardından bunu siyah taban plakasına kaydırarak bitmiş direklerin doğru uzunlukta olduğundan emin olun. Biyoreaktörü otoklavladıktan ve hücre karışımını hazırladıktan sonra, hECT'leri üretmeye devam edin.
Steril eldivenler giyerek, biyoreaktör parçalarını içeren otoklavlanmış torbadan siyah taban plakasını çıkarın ve kuyucukları yukarı bakacak şekilde 60 mililitrelik bir tabağa yerleştirin. Kabarcıkların oluşmasını önlemek için 44 mikrolitre hücre karışımını her bir kuyucuğa yavaşça pipetleyin. Yeni bir çift steril eldiven giyerek, PDMS rafları ile polisülfon çerçeveyi otoklav torbasından çıkarın.
Çerçeveyi, çerçevenin uçları taban plakasının ucundaki oluklara oturacak şekilde taban plakasına indirin. Direklerin düz olduğundan ve çerçevenin eğilmediğinden emin olarak, biyoreaktörü 60 milimetrelik bir çanağa yerleştirin. HEKT'ler katılaştıkça nemi artırmak için 60 mililitrelik tabağa kardiyomiyosit bakım ortamında bir mililitre% 10 FBS ekleyin.
Çanağı kapaksız olarak yüksek profilli 100 milimetrelik bir tabağa yerleştirin ve 100 milimetrelik bir tabak kapağıyla örtün, ardından kollajenin süspansiyondaki hücrelerle bir jel oluşturmasını sağlamak için biyoreaktörü 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne geri koyun. İki saat sonra, çanağı inkübatörden çıkarın. Kardiyomiyosit bakım ortamına 13 mililitre %10 FBS ekleyin, ortamın PTFE taban plakası ile PDMS rafları arasında akmasına izin vermek için çanağı eğin.
Biyoreaktörde hava kabarcığı olup olmadığını yandan kontrol edin ve çanağı inkübatöre geri koyun. Hava sıkışırsa, kabarcığın kırılmasına izin vermek için biyoreaktörü ortamdan dışarı eğin ve yavaşça tekrar indirin veya direkleri rahatsız etmeden havayı sifonlamak için jel yükleme uçlu bir mikro pipet kullanın. Çerçevedeki pencereden hECT sıkıştırmasını kontrol edin.
24 ila 96 saat boyunca, hECT'ler sıkışır ve opak hale gelir. hECT'ler orijinal çapa kıyasla en az %30 sıkıştırıldığında taban plakasını çıkarın. Biyoreaktörü içeren 60 milimetrelik kabı, sıvı çanağın dudağı ile akana kadar kardiyomiyosit bakım ortamı ile doldurun ve 60 milimetrelik yeni bir kaba 14 mililitre ekleyin.
Steril eldiven giyerken, biyoreaktörü, taban plakası üstte olacak şekilde çanağında ters çevirin. Sıkışmış hava kabarcıklarını kontrol ettikten sonra, taban plakasını düz tutarak yavaşça kaldırın. Gönderi ipuçlarının odakta olduğundan emin olun.
Eşik anahtarını açın ve SPoT'ler güzel bir şekilde ayrılana ve hECT daraldıkça şekil değiştirmeyene kadar kaydırıcıyı ayarlayın. SPoT'lerden birinin çevresine bir dikdörtgen çizmek için dikdörtgen aracını kullanın ve SPoT'nin her zaman dikdörtgenin sınırları içinde kalmasını sağlamak için SPoT'nin etrafındaki dikdörtgen konumunu ayarlamak için yazı sınırları kutusunun içindeki bir tane ayarla düğmesine tıklayın. İşlemi diğer gönderiye tekrarlayın ve ikinci setin altına kaydedin.
Programın daha küçük nesneleri izlemesini önlemek için nesne boyutu ayarlarını yapın ve her dikdörtgende izlenen nesne sayısının sabit kalmasını sağlayın. Arayüz, izlenen nesneler arasındaki ölçülen mesafeyi gerçek zamanlı olarak gösterir. Gürültüyü izlemek için bu grafiği kullanın.
Pacing frekansı hertz başlığı altında, istenen frekans aralığını ve minimumdan maksimuma adım atmak için istenen aralığı belirtin. Sağdaki kutularda, hECT'nin yeni ilerleme hızı frekansına uyum sağlamasına izin vermek için istediğiniz ayar süresini seçin, ardından kayıt süresini ve ilerleme hızı voltajını belirtin. Programı başlat düğmesine tıklayarak programı başlatın.
Bir frekanstan gelen veriler kaydedildikten sonra, maksimum frekansa ulaşılana kadar yeni bir kayıt için stimülatör frekansını istenen aralıkta artırın. HKT'lerin temsili görüntüleri, SPoT'ler olmadan ve SPoT'lerle oluşturulmuş, alttan görüntülendiği gibi burada gösterilmektedir. SPoT'ler, veri toplama sırasında izlenecek tek bir tanımlanmış şekil sağladı.
Bazı aşırı durumlarda, izleme nesnesi bile gizlendi. Optik izleme ve gürültü azaltma için daha güvenilir bir şekil, zayıf dokuların bir mikro Newton kadar düşük bir kuvvetle ölçülmesini sağladı. SPoT'ler, hECT kaybını önleyen bir kapak geometrisi sağladı.
Ölçülen hECT fonksiyonu, ısıtılmış aşama ile mevcut pacing kurulumunda uzatılmış kültür süresi boyunca stabildi. Fizyolojik sıcaklıktaki ölçümlerle karşılaştırıldığında, hEKT'ler oda sıcaklığında daha yavaş kasılma ve gevşeme oranları ile değişen kasılma dinamikleri gösterdi. Daha yüksek frekanslarda, hEKT'ler oda sıcaklığında daha zayıf olma eğilimindeydi.
Daha düşük frekanslarda, hECT'ler oda sıcaklığında daha güçlü olma eğilimindeydi. 36 santigrat derecede tempolu olduğunda, hECT'ler daha yüksek bir spontan vuruş hızına ve daha geniş bir yakalama frekansı aralığına sahipti. Sıcaklık kontrollü ortam, ölçülen hECT fonksiyonunun fizyolojik uygunluğunu sağlar.
Ek olarak, çok dokulu biyoreaktörün paylaşılan ortam banyosu, farklı hücresel bileşimlerin hEKT'leri arasında parakrin sinyalleme çalışmalarını kolaylaştırır. SPoT'lerin çok dokulu biyoreaktörümüze eklenmesi, araştırmacıların anormal derecede yüksek veya düşük gerilimli hastalıklı miyokardları verimli bir şekilde incelemelerine olanak tanır, aksi takdirde kapaksız direklerin uçlarından kayar.
