Bu protokol, aedes aegypti sivrisineklerinde uygunluğu yansıtan standart ölçümleri gösterir, bu uygunluk parametreleri üreme başarısını yansıttıkları, ölçülmesi basit oldukları ve literatürde yaygın olarak bildirildikleri için seçilmiştir. Başlamak için, transgenik ve vahşi tip sivrisinekleri yumurtadan çıkarmak için yumurta kağıtlarını gece boyunca steril suya koyun. Birkaç damla öğütülmüş balık yemi bulamacı sağlayarak larvaların ad libitum beslenmesine izin verin.
Yetişkinlerin bakire olduğundan emin olmak için, pupaları ortaya çıktıklarında cinsiyetlerine göre ayırın, pupaları bir cam mikroskop lamına taşıyın ve pupayı hareketsiz hale getirmek için fazla suyu doku ile birlikte alın. İki kat ila dört kat büyütmeli bir stereoskop altında, ince uçlu bir boya fırçası kullanarak, pupayı yüzü yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Daha sonra genital lob şeklindeki farklılıklar için kuyruğu görsel olarak analiz edin.
Erkek ve dişi pupaları uygun muhafazada ayrı su kaplarına koyun. Yabani tip veya transgenik gen sürüşü bir veya gen sürüşü iki erkeği bakire vahşi tip dişilerle kütle üzerinde çaprazlamak için, yaklaşık 150 sivrisinek içeren sivrisinek kartonlarına beş erkeğe bir dişi oranlarında anestezi uygulanmış sivrisinekler ekleyin. İki ila üç gün sonra, standart yetiştirme uygulamalarını izleyerek dişileri beslemek için kafes üzerinde bir kan kaynağı sağlayın.
Kanla beslenen dişileri, karınlarını şişkinlik açısından görsel olarak tarayarak ve beslenmeyenleri kısmen, beslenen ve erkekleri atarak beslenmemiş dişilerden ayırın. Tıkanmış dişileri kendi kafeslerine geri koyun. İki ila üç gün sonra, tek tek dişileri, kurşun kalemle önceden etiketlenmiş filtre kağıdı ile kaplı 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin.
Tüm tüpleri beş mililitre musluk suyu ile doldurun. Her konik tüpün üzerine küçük bir parça kuru üzüm veya şekere batırılmış pamuk topu yerleştirin. Dişileri bir ila iki gün boyunca insectory'de bırakın ve yumurtlamalarına izin verin.
Daha sonra her bir kağıda düşen yumurta sayısını sayın ve her bir kağıda sayılan yumurta sayısının taranan dişi sayısına bölünmesiyle ortalama doğurganlığı hesaplayın. Yumurta kağıtlarını kurutmak için tüplerdeki suyu boşaltın ve tekrar iç kısımlara yerleştirin. Tamamlanan doğurganlık çalışmasından kanla beslenen dişileri dondurmak için, sivrisinek kafeslerini yaklaşık 15 dakika boyunca eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin.
Her sivrisineğin sol kanadını inceleyin, kanadın ve göğüs kafesinin eklemini çıkarın ve tüm kanadı çıkarın. Forseps kullanarak, kanadı düz bir cam slayt üzerine yerleştirin, ardından bir transfer pipeti kullanarak slayttaki kanada% 70 etanol ve bir damla bulaşık deterjanı içeren 15 mililitrelik stok çözeltisinden bir damla ekleyin. Daha sonra, kapak fişine bir damla% 80 gliserol ekleyin ve etanol sabunu çözeltisinde kanadın üzerine yerleştirin.
65 milimetre lensli bir kamera kullanarak kızaklara monte edilen kanatları fotoğraflayın. Yer işaretleri için iki boyutlu Kartezyen koordinatları tanımlamak için TpsDig yazılımını kullanın. El yazmasında verilen R yazısını kullanarak kanat uzunluğunu ve alanını hesaplayın.
Bir boyut ölçüsü olan kanat merkez büyüklüğünü, her bir yer işaretinin kanat Hatch'in merkez noktasından kare mesafelerinin toplamının karekökü olarak tanımlanan şekilden istatistiksel olarak bağımsız olarak hesaplayın, tek tek F1 yumurtalarını tek dişilerden toplanan kağıtlardan 100 mililitre taze sterilize edilmiş deiyonize su içeren polipropilen berrak şarküteri kaplarına koyun. Yumurtadan çıktıktan iki ila üç gün sonra, yumurta kağıtlarını sudan çıkarın ve gece boyunca kurumaya bırakın. Yumurta kağıtlarını ilk olarak yumurtadan çıktıkları kaplarda tekrar çatlatın.
İlk yumurtadan çıktıktan üç ila beş gün sonra, larvaları transgenik bir belirteç açısından görsel olarak inceleyin. Pozitif veya negatif transgenik larvaların sayısını kaydedin. Negatif larvaları atın.
Doğurganlığı, transgenik veya kontrol larvalarının sayısının toplam yumurta sayısına bölünmesiyle hesaplayın. Cinsiyet oranını belirlemek için, her bir yetişkin dişi sivrisinek başına çalışma zaman çizelgesi boyunca toplanan dişi sayısını veya erkek sayısını ekleyin. Bu sayıyı, tek bir dişi tarafından üretilen aynı sivrisinek hattı için toplanan pupa sayısına bölün.
Larva canlılığını belirlemek için, yetişkin dişi sivrisinek başına çalışma zaman çizelgesi boyunca toplanan toplam pupa sayısını ekleyin. Bu sayıyı, daha önce sayılan aynı çizgi için bireysel yetişkin dişi sivrisinek başına sayılan larva sayısına bölün. Yumurtadan çıktıktan sonra pupa gelişimine kadar geçen ortalama süre olarak larvalardan pupa gelişimine kadar hesaplayın.
Erkek katkısını belirlemek için, 50 transgenik veya kontrol erkeğini 100 kontrol dişisi ile 64 onsluk kartonlara çaprazlayın, böylece 100 dişi ile 50 erkek olur. Çiftleşmeden sonra, standart yetiştirme uygulamalarını takip ederek sivrisineklere kan yemeği verin. Daha sonra, tamamen tıkanmış dişileri önceden etiketlenmiş beyaz filtre kağıdı ile kaplı 50 mililitrelik konik tüplere ayırın.
Dişileri bir ila iki gün boyunca insectory'de bırakın ve yumurtlamalarına izin verin. Kağıtların en az beş gün boyunca sektördeki tüplerde kurumasını bekleyin. Kağıtları çıkarmak için forseps kullanın ve yumurtadan çıkmak için yerleştirin.
Yumurtadan çıktıktan iki ila üç gün sonra, yumurta kağıtlarını sudan çıkarın ve kurumasını bekleyin. Yumurta kağıtlarını aynı kaplarda tekrar çatlatın. İlk yumurtadan çıktıktan üç ila beş gün sonra, larvaları transgenik bir belirteç açısından görsel olarak inceleyin.
Erkek katkısını, F2 transgenik larva sayısının sivrisinek hattı başına toplam larva sayısına bölünmesiyle hesaplayın. 50 erkek ve 50 dişi yabani tip veya transgenik yaşa uygun, kanla beslenmeyen sivrisinekleri uygun bir muhafazaya aktarın. Her gün ölü erkek ve dişi sivrisineklerin sayısını takip edin.
Uzun ömürlülüğü, sivrisineklerin kafeslerde ölmeden önce geçen ortalama gün sayısı olarak hesaplayın ve bilgilendirici olmayan nedenlerden ölen sivrisinekleri atlayın. Larvaların erişkin pupalara ve pupaların erişkin gelişim süreleri, Kruskal-Wallis'ANOVA ve Dunn'ın post hoc karşılaştırmaları ile değerlendirildi. Yabani tip erkek sivrisinekler, yabani tip dişilere göre daha kısa bir pupa süresine sahipken, D7L1 bir erkek, D7L1 dişilerine göre yavrulanma sürelerinde önemli bir farklılık göstermedi.
D7L1 dişilerinin, vahşi tip erkeklere göre, D7L1 erkeklerinde olduğu gibi, vahşi tip dişilere göre yavruya ulaşması daha uzun sürdü. Pupalar ile yetişkin gelişim süresi ile ilgili olarak, yabani tip ve D7L1 dişiler önemli ölçüde farklılık göstermedi, yabani tip erkekler yabani tip dişilerden ve D7L1 erkeklerden daha hızlı pupa olur. Yabani tip dişi sivrisinekler, çalışma sırasında medyan hayatta kalma sürelerine asla ulaşmadı.
Diğer tüm gruplar, medyan sağkalım sürelerinin belirgin bir zamansal ayrımı ile 40 günden önce medyan sağkalımlarına ulaştı. D7L1 nakavt sivrisinekleri, vahşi tip muadillerine göre önemli ölçüde daha küçük bir kanat alanına sahipti, ancak kanat veya sentroid boyutunda hiçbir fark yoktu. Nanos veya ZPG promotörlerinin ekspresyonu altında bir gen sürücü kasetinin bir kopyasını barındıran sivrisinekler, larva canlılığının dikkate değer bir istisnası dışında, Higgs geniş göz çizgisine kıyasla önemli ölçüde farklı bir uygunluğa sahip değildi.
Burada toplanan fitness verileri, matematiksel modelleme gibi sonraki uygulamalarda kullanılabilir. Yeni genetik kontrol stratejilerini değerlendiren çalışmalar için, burada özetlenen küçük beceri uygunluk çalışmalarından sonra yarı tarla koşullarında daha büyük kafes çalışmaları gerekli olacaktır. Laboratuvardaki fitness çalışmaları, gen nakavtlarının veya nakavtlarının istenmeyen etkilerini belirlemeye yardımcı olur.
Bir tükürük proteinini devre dışı bırakmak gelişimsel strese neden olabilirken, bir ve iki sivrisinek gen sürücüsündeki gen sürücüsü daha düşük larva hayatta kalma oranları gösterdi. Gen sürücü uygunluğunun ölçülmesi, matematiksel modellemeden sonra popülasyonları simüle etmedeki kalıcılığını güçlü bir şekilde etkiledi.
