Fare embriyolarındaki organogenez aşamaları, embriyo kompleks yapılarının zor görselleştirilmesi nedeniyle kısmen zayıf bir şekilde çalışılmaktadır. Bu protokol, eksenel genişleme ve segmentasyon sırasında fare embriyolarının 3D ve 4D görselleştirmesine ve analizine izin veren teknikleri açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların fare embriyosunun karmaşık yapılarını 3D dinamik nesneler olarak incelemelerine ve göstermelerine izin vermesidir.
Bu protokol, skolyoz gibi memelilerin omurlarını ve omuriliğini etkileyen konjenital malformasyonların incelenmesinde kullanılabilecek teknikler içerir. Bu teknikler in vitro model sistemlerle de kullanılabilir, böylece insan embriyonik gelişiminin incelenmesine izin verilir. Canlı görüntüleme için embriyonik gün 8.25 ile embriyonik gün 10.5 arasında fare embriyoları hazırlamak için, embriyoları önceden ısıtılmış M2 ortamında 37 santigrat derecede diseke edin.
Temiz forseps kullanarak yumurta sarısı kesesini nazikçe çıkarın ve diseksiyon sırasında üretilen kan ve kalıntıları çıkarmak için embriyoyu bir kez taze M2 ortamı ile yıkayın. Canlı görüntüleme prosedürü sırasında, embriyoları% 10 HyClone tanımlı FBS, iki milimolar L-glutamin ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş düşük glikozlu DMEM ortamında, 37 santigrat derece ısıtılmış bir odada ve% 5 karbondioksit ortamına sahip% 65 oksijen ile inkübe edin. İmmünofloresan mikroskopi için benzer aşamadaki fare embriyolarını hazırlamak için, ısıtılmış M2 kullanmak yerine, embriyoları soğuk PBS'de diseke edin ve% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
Metin makalesinde açıklandığı gibi tüm mount immünofloresan boyama protokolü uygulandıktan sonra, RapiClear kullanılarak doku temizliği sağlanabilir. İlk olarak, embriyoları 75 x 25 milimetrelik bir çöküntü içbükey cam slaytın ortasına yerleştirin, mikroskop çöküntü slaytındaki tüm PBST'yi çıkarın ve 200 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin, ardından slayt hazırlığını bir kutu ile örtün. Işıktan korunan 10 dakika sonra, embriyolar şeffaf hale gelmeye başladığında, temizleme solüsyonunu değiştirin ve 20 dakika daha bekleyin.
Embriyoyu bir taraftan başlayıp yavaşça diğer tarafa doğru hareket eden bir örtü ile doldurun. Örnek artık görüntüleme için hazırdır. Metil salisilat veya BABB kullanarak temizleme için, embriyoların% 100 metanol içinde tamamen dehidrate olduğundan emin olun ve daha sonra konsantrasyonda% 20 ardışık artışlar ve her adım için 20 dakikalık bir inkübasyon ile BABB ve metanol serisine başlayın.
BABB çözümü% 100'e ulaştığındaYeni bir çözüm için iki ek değişiklik yapın. Numunenin sıkıştırılmasını önlemek için embriyoları monte etmek için 20 x 60 milimetre 1,5 kapak camı slayt hazırlayın. İnce metal yıkayıcılardan yapılmış ara parçalar ekleyin.
Temizlenen embriyoları bir kürdan, ince bir pamuk ucu veya bir Pasteur pipeti kullanarak mikroskop slaytlarına aktarın. Daha sonra bir damla montaj ortamı ekleyin, başka bir benzer kapak camıyla örtün ve kabarcıkları önlemek için hazırlığı daha iyi stabilize etmek için erimiş parafin ile kapatın. Kapak kaymasını bir tarafa yerleştirin ve ardından yavaş yavaş ve yavaşça yana doğru kaydırın, gerekirse daha fazla ortam ekleyin.
Örnek şimdi mikroskopta görüntülenmeye hazırdır. Görüntülemeden sonra embriyoyu standartlaştırılmış bir ön-posterior ve dorsal-ventral eksen pozisyonuna yeniden konumlandırmak için Fiji / ImageJ kullanın. Fiji'nin görüntüsündeki veri kümesi boyutunu azaltın, ardından veri kümesini 200 megabayttan daha azına düşürmek için gereken X, Y ve Z ölçek değerlerini ölçeklendirin ve ekleyin.
Yeni pencere oluştur seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Ardından eklentilere gidin ve 3D Viewer'ı açın. 3B Görüntüleyici penceresinin içinde, embriyoyu seçmek için üzerine tıklayın ve kırmızı bir 3B kutunun görünmesine neden olun.
Bu modu kullanırken, veri kümesinin dönüşünü fare ile denetleyin. Embriyonun mükemmel konumunu sağladıktan sonra, düzenle'yi seçin, görüntüyü dönüştürün ve dönüştürülmüş görüntüyü 3D Viewer penceresinde dışa aktarın. Farklı ortogonal düzlemleri inceleyin, ardından görüntüye gidin, ardından ortogonal görünümleri yığınlayın ve seçin.
Embriyo doğru konumlandırıldığında, 3B Görüntüleyici pencere menüsünü seçin, ardından dönüştürme matrisini düzenleyin, dönüştürün ve mat uzantılı bir metin dosyasına kaydedin. Metin dosyasını Fiji/ImageJ kullanarak açın, ilk iki satırı kaldırın ve yeniden kaydedin. Bu, TransformJ eklentisiyle uyumlu bir dönüşüm matrisi dosyası oluşturur.
Tam çözünürlüklü veri kümesine geçin ve TransformJ ve TransformJ affine işlem eklentilerini gerçekleştirin. Yeni pencerede, daha önce kaydedilmiş matris dosyasını aramak için göz atın, kübik B-spline enterpolasyonunu seçin ve izotropik olarak yeniden örnekleyin, ardından Tamam'ı tıklayın. Embriyoyu düzgün bir şekilde yeniden konumlandırdıktan sonra, oluşturulan boş alanın çoğunu kesin. Tam bir Z projeksiyon görüntüsü gerçekleştirmek için yığınlara, Z Projesi'ne tıklayın ve maksimum yoğunluğu seçin.
Ardından, X ve Y'deki tüm embriyoyu içeren minimum yatırım getirisini çizin.Düzenle, seçim, seçimi geri yükle ve görüntüyü seçerek kırp'a tıklayarak orijinal veri kümesi görüntü pencerelerine geçin. Görüntü seçerek ve yığınları açarak embriyo dokularıyla kesişmeyen başlangıçtaki ve sondaki dilimleri kesin, araçlara tıklayın, dilim sökücüyü seçin ve çıkarılacak ilk ve son dilimi belirtin, artışı bire değiştirdiğinizden emin olun. İstenirse, metin makalesindeki talimatları kullanarak daha fazla analiz ve 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirin.
Daha gelişmiş embriyoların 3D analizini yapmak için, embriyonik gün 18.5 fetüslerini soğuk PBS'de diseke edin, tüm ekstra embriyonik zarları çıkarın, daha sonra diseksiyon prosedürü sırasında üretilen kan ve kalıntıları çıkarmak için fetüsleri taze PBS'de birkaç kez yıkayın. PBS'de yapılan fetüsleri% 4 PFA'da beş ila yedi gün boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Embriyoyu PBS'de birkaç kez yıkadıktan sonra,% 100 metanole ulaşılana kadar% 10 metanol çözeltisinin art arda 10 artışını inkübe ederek fetüsleri dehidrate edin.
Her inkübasyonu oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 25 dakika boyunca gerçekleştirin. Daha sonra, fetüsleri önce metanolde% 5 hidrojen peroksitte bir gün boyunca bir çalkalayıcı üzerinde ayrı ayrı inkübe edin ve daha sonra embriyolar tüm doğal pigmentasyonu kaybedene kadar üç güne kadar metanolde% 10 hidrojen peroksit içinde inkübe edin. Embriyoları ters metanol serisinde demineralize suda kademeli olarak rehidre edin, her inkübasyonda oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübasyon, daha sonra embriyoları demineralize suda yıkama başına 30 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Fetüsleri% 1 agaroz bloklarına gömmek için, 50 mililitrelik bir plastik tüp veya şırıngayı erimiş agarozla doldurun, ardından fetüsü agaroza dikey bir pozisyonda yerleştirin ve agarozun katılaşması sırasında forseps ile bu pozisyonu koruyun. Agarozun tamamen jöle yapması için kalıbı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede blokla yerleştirin, ardından agaroz bloğunu fetüsle birlikte kalıptan çıkarın ve demoralize su içeren bir kaba koyun. Demineralize su veya PBS ile seyreltilmiş metanol konsantrasyonunda% 10'luk artışlarla fetüs dehidrasyonunu kademeli olarak gerçekleştirin, numuneyi% 100 metanole ulaşılana kadar bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında en az 45 dakika metanol konsantrasyonunda tutun.
Fetüsleri, her konsantrasyonda 2.5 saat boyunca bir dizi BABB çözeltisi ve metanol ile hareket ettirerek temizleyin ve BABB konsantrasyonunda% 100 BABB'ye ulaşana kadar% 25 artış sağlayın. BABB çözeltisini, fetüs tamamen şeffaf olana kadar her gün taze bir çözelti ile değiştirin. Bu işlem üç ila beş gün sürebilir.
Temizlenmiş agaroz bloğunu OPT tarayıcısının motor eksenine bağlamak için yapıştırıcı kullanın, ardından tüm fetüsün görüntüsünü elde etmek için optikleri ayarlayın ve tam bir projeksiyon veri kümesi elde etmeye devam edin. 4D canlı görüntüleme tekniği, LuVeLu muhabir ekspresyonunun ve embriyonik gün 8.5 Snai1 koşullu nakavt embriyolarının dinamik analizini sağlar. Presomitik mezodermdeki normal LuVeLu sinyalinin yanı sıra, Snai1 koşullu nakavt embriyoları, ilkel çizgiden kaynaklanan ektopik çıkıntıda LuVeLu ekspresyonunu gösterir.
Tüm montaj immünofloresan testleri, potansiyel NMP'lerin ve mezoderm farklılaşmasının anahtar düzenleyicilerinin tespit edilmesini sağlar. Beyaz ve sarı oklar, mutant ve vahşi tip embriyolardaki farklılıkları vurgular. Tüm montaj immün boyamalarının 3D render'ı, çalışmadaki doku veya yapının daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Bu durumda, potansiyel NMP'lerin kuyruk tomurcuğundaki yeri araştırıldı. 3D doku rekonstrüksiyonları, fare embriyolarındaki morfolojik kusurları anlamak ve karakterize etmek için de önemlidir. 3D rekonstrüksiyonun etkileşimli görselleştirilmesi de kullanıcı dostu formatlarda oluşturulabilir.
Örneğin, bir PDF dosyasında. Bu 3D embriyo kaudal yapıları, 3D modellerin gücünü daha genel bir kitleye göstermek ve omurgalı eksenel uzama ve segmentasyonunu öğretmede çalışmaya yardımcı olmak için kullanılabilir. Son olarak, OTP mikroskopi tekniği kullanılarak daha gelişmiş fare embriyolarının toto görselleştirmesinde 3D mümkündür.
Embriyonik gün 18.5 fetüslerinin anahtar dilimlerini vurgulayan animasyonlu render'lar burada gösterilmektedir. Hatırlanması gereken en önemli şey, sonucun embriyoda gözlemlenenlerin sadık bir temsili olarak kalması gerektiğidir. Araştırmacılar bu yöntemleri, görüntülere sadece statik sunmanın ötesine geçmek için kullanabilirler, ancak aynı zamanda videolar, üç boyutlu rekonstrüksiyonlar ve hatta verilerinin etkileşimli 3D modellerini de içerebilirler.
