Bu yöntem, insan sıtma paraziti, P.Falciparum biyolojisinde anahtar sorulara cevap yardımcı olarak, koşullu nakavt yoluyla protein fonksiyonu ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, önceki yöntemlere göre koşullu mutantların nispeten kolay nesil sağlar olmasıdır. Başlamak için Chop Chop'a gidin ve Fasta Target'Under Target'ı seçin, bir genin açık okuma çerçevesinin üç ana ucundan 200 baz çiftini ve genin üç ana UTR'sinin başlangıcından itibaren 200 baz çiftini yapıştırın.
In'select P.Falciparum'un altında ve CRISPR/Cas9'under'ı seçin'Next' seçeneğini tıklatın, sunulan seçeneklerden Hedef Siteleri Bul'Select'in bir gRNA dizisini seçin, modifikasyon sitesine en yakın ve hedef dışı en az siteye sahip olan en verimli gRNA'yı tercih edin. Satın gRNA dizisi ve poliakrilamid jel elektroforez saf oligos olarak ters kompleman. PfH-sp70x'i hedeflemek için kullanılan gRNA dizisi metin protokolünde bulunabilir.
Steril 1,5 milimetrelik bir santimetrelik santimetrelik tüpe pMK-U6, pUF1-Cas9 ve pHA-glmS DNA'sının her birini 40 mikrogram ekleyin. Suya üç azı lı sodyum asetat DNA hacminin onda birini tüpüne ekleyin ve bir girdap kullanarak iyice karıştırın. Daha sonra, tüpe yüzde 100 etanol hacmi 2,5 kat ekleyin ve en az 30 saniye boyunca bir girdap kullanarak iyice karıştırın.
Tüpü buza veya eksi 20 derecede 30 dakika yerleştirin. Sonra, tüpü 18, 300 kez G'de 30 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Santrifüjden sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatantı tüpten dikkatlice çıkarın.
Tüpe yüzde 70 etanol hacminin üç katını ekleyin ve bir girdap kullanarak kısa bir süre karıştırın. Tüpü 18, 300 kez G'de 4 santigrat derecede 30 dakika santrifüj edin. Yine, dikkatle pelet rahatsız etmeden tüpten supernatant çıkarın.
Tüpü açık bırakın ve peletin 15 dakika kurumasını bekleyin. Çökelmiş DNA'yı transfeksiyon için gerekli olana kadar eksi 20 derecede saklayın. Transfect RBC'ler için, metin protokolünde açıklandığı gibi 1X sitomix arabelleği ve eksik ve eksiksiz RPMI hazırlayın.
Filtre 0,22 mikron filtre kullanarak arabellek sterilize. Çözünmek için DNA ve girdap için 1X sitomix 380 mikrolitre ekleyin. DNA'nın 1X sitomikte 10 dakika boyunca erimesine izin verin, her üç dakikada bir 10 saniye girdap.
Steril bir, 15 mililitre konik tüp, 1X sitomix dört mililitre ile tamamlanmamış RPMI izole insan RbCs 300 mikrolitre birleştirir. RBC'leri 870 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Sonra RBC pelet supernatant çıkarın.
DNA-sitomik karışımı ile RBC pelet yeniden askıya ve 0.2 santimetre elektroporasyon cuvette aktarın. Metin protokolünde listelenen koşulları kullanarak RBC'leri porate. Elektroporasyondan sonra, içindekileri cuvette'den beş mililitre tam RPMI içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Tüpü 870 kez G'de 20 santigrat derecede üç dakika santrifüj edin. Sonra, supernatant decant. Şimdi, peleti dört mililitre lik tam RPMI'de yeniden askıya alıp altı kuyulu doku kültürü plakasında ki bir kuyuya aktarın.
Aktarılan RBC'lere 400 mikrolitre yüksek schizont kültürü ekleyin. Ertesi gün, tam RPMI dört mililitre ile kültür yıkayın.
Kültürü 870 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire. Dört mililitre tam RPMI kültürü yeniden askıya alın.
48 saat sonra, tam RPMI dört mililitre ile kültür yıkayın. Daha sonra, Cas9 plazmid için seçmek için bir mikromolar DSM1 içeren tam RPMI kültürü yeniden askıya. Bu noktadan sonra, taze tam RPMI artı bir mikromolar DSM1 her 48 saatte bir kültür ortamı değiştirin.
Parazitler artık kan yayma ile görünür kadar tam RPMI ile her gün kültürleri yıkamaya devam edin. Bir kan bulaşması yapmak için, pipet kültür 150 mikrolitre bir 0.6 mililitre santrifüj tüp içine. Hücreleri santrifüj ile 30 saniye boyunca 1, 700 kez G'de peletledıktan sonra, süpernatanttan aspirasyon.
Peletli hücreleri cam bir slayta aktarmak için bir pipet kullanın. İlk slayt için 45 derecelik açıyla düzenlenen ikinci bir cam slayt kullanarak, kan damlacık smear. Üreticinin protokolüne göre ticari olarak kullanılabilen bir boyama kiti kullanarak slaydı lekeleyin.
Parazitleri 100 kez yağ daldırma amacı kullanarak görüntüleyin. Transfeksiyon sonrası beş gün başlayarak, kültür ortamında yeniden askıya alınan KÇ'ler ile kültürün iki mililitresini çıkarın. %2 hematokrit taze orta ve kan iki mililitre geri ekleyin.
Parazit yeniden ortaya çıkana kadar haftada bir kez bu şekilde taze kan ekleyin, ince kan yayma tarafından belirlenen. 200 mikrolitre başına 0,5 parazit son konsantrasyonu elde etmek için parazit kültürünün seri seyreltme gerçekleştirin. 96 kuyulu doku kültürü plakasının kuyularına seyreltilmiş kültürün 200 mikrolitresini ekleyin.
Parazitler kuyularda tespit edilene kadar klonlama plakasını koruyun. Her 48 saatte bir, 96 kuyulu tabaktaki ortayı taze orta ile değiştirin. Haftada bir kez, klonlama plakası başladıktan beş gün sonra, her kuyudan 100 mikrolitre çıkarın ve taze orta artı kan 100 mikrolitre geri ekleyin.
Parazit içeren kuyuları belirlemek için, 96 kuyulu plakayı yaklaşık 20 dakika boyunca 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve kanın plaka içinde bir açıyla yerleşmesini bekleyin. Daha sonra, 96-kuyu plakasını bir ışık kutusuna yerleştirin. Parazit içeren kuyuların, parazitsiz kuyuların pembe ortamına kıyasla, parazitsiz kuyuların pembe ortamına göre sarı renkli ortam içerdiğine dikkat edin.
Serolojik pipet kullanarak, parazit içeren kuyuların içeriğini parazitin genişlemesine izin vermek için 24 kuyulu doku kültürü plakasına taşıyın. PCR çözümlemesi kullanarak, doğru tümleştirme için bu klonal parazit hatlarını kontrol edin. Bir immünüffloresans tahsin sonuçları burada gösterilmiştir, PfH-sp70x başarılı HA etiketleme gösteren.
PfH-sp70x glmS parazitleri bir çekirdek belirteci olarak DAPI ile ve HA antikorları ile sabit ve lekeli idi. Membran ilişkili histidin zengin protein bir, konak RBC protein ihracatı bir belirteç. Burada glukozamin ile tedavi sonrası PfH-sp70x protein düzeyinin Western Blot analizi gösterilmiştir. Beklendiği gibi, tedavi süresince protein düzeyi azalır.
Bu teknik, parazitoloji alanında araştırmacıların sıtma parazitinin biyolojisindeki temel soruları araştırmalarının önünü açsA. P.Falciparum'un kan yoluyla bulaşan bir patojen olduğunu ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipmanın takılması gerektiğini unutmamak gerekir.
