Böceklerin tükürük bezleri, birçok insan hastalığını iletmek için gereklidir. Bu yüzden maaş bezi biyolojisinin daha iyi anlaşılması, hastalık önleme için mevcut stratejilere katkıda bulunmalıdır. Bu teknik, aday düzenleyicilerdeki mutasyonların sivrisinek larva tükürük bezlerinin morfolojisini etkileyip etkilemediğini ve sıtma parazitlerinin bulaşmasını potansiyel olarak etkileyip etkilemediğini hızlı bir şekilde sormamıza izin verecektir.
Sivrisinek larvaları ile ilk birkaç kez çalıştığınızda, hızlı hareket ettikçe kavramaları zordur. Ne kadar çok pratik yaptırırsan, o kadar iyi olursun. Prosedüre başlarken, laboratuvarımın lisans araştırma asistanı Marisol Luchetti olacak.
Deneye başlamak için, bir diseksiyon mikroskobu aşamasına bir lazımlık plakası yerleştirin ve 10 sivrisinek L4 larvasını lazımlık plakasına aktarın. Daha sonra larvalardan ayrı lazımlık plakasına diseksiyon çözeltisinden bir damla yerleştirin. Bir L4 larvasını% 25 etanol diseksiyon çözeltisi damlasına yerleştirmek için forseps kullanın.
Her elde beş numaralı bir asa tutarak, larvaları başın hemen altında, baskın el ile kavrayın ve larva başını baskın olmayan el ile kavrayın, ardından bezler başa bağlı kalırken, vücudun geri kalanından kopmak için başı minimum sabit kuvvetle hafifçe çekin. Larva karkasının vücut kısmını attıktan sonra, baş veya tükürük bezlerini bir mililitre PBS'de, 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde toplayın ve tükürük bezlerinin tamponun dibine batmasını bekleyin. Ertesi gün, dokuları sabitlemek için çözeltiyi 90 saniye boyunca bir mililitre soğuk% 100 aseton ile boşaltın.
Asetonu çıkardıktan sonra, dokuları bir mililitre PBS ile üç kez hafifçe durulayın. İmmün yetinme için, PBS'nin toplam hacminin 200 mikrolitresinde, uygun seyreltmede Rab 11 gibi birincil bir antikor ekleyin. Boru içeriğini bir pipet ucuyla hafifçe döndürün.
Primer antikorları bir gecede dört derecede kuluçkaya yatırın, ardından bir mililitre PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra ikincil antikor olan Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit'i uygun seyreltmede toplam hacmin 200 mikrolitresinde ekleyin. İçeriği bir pipet ucuyla karıştırdıktan sonra, dokuları Nil kırmızısı ve Hoechst gibi boyalarla 60 dakika oda sıcaklığında 200 mikrolitre PBS'ye inküboz edin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın.
Bir pipet ile 200 mikrolitre% 100 gliserol ekleyerek ve yumuşak bir fırça kullanarak mikroskop slaytı başına ekli bezler ve iç yapılarla 20'ye kadar lekeli kafa aktararak bir mikroskop slaytı hazırlayın. Kafa örneklerini cam slayt boyunca eşit olarak dağıtmak için dışarı yayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleme, larva başını bezlerden ayırın, iki çift kümes gücü kullanarak, iki dokuyu dikkatlice zıt yönlere çekerek.
Tüm numuneler yapıldığında, 1,5 milimetre kalınlığında bir kapak kaymasını yavaşça kaydırağın üzerine yerleştirin, hava kabarcıklarının oluşumunu önleyin ve ardından kaydırağı açık oje ile kapatın. Tükürük bezlerinin dördüncü evre larvalardan parçalanmaları nispeten kolaydır. Erkek ve dişi larvalar, geç L4 larva aşamasında, dişilerin sırt toraksı boyunca kırmızı bir şeritle ayırt edilebilir.
Anten morfolojisi de, erkeklerde, görülebileceği gibi dişi L4 larvalarından daha ayrıntılıdır, beyaz oklar işaret edilir, sol görüntüdeki dişi antenler ve sağdaki erkek antenleri. Erken L4 evre larvalarından izole edilen, Hoechst ile lekelenmiş tükürük bezleri, dar bir daralma ile ayrılmış proksimal ve distal lobları ortaya çıkarmaktadır. Oluşturan lümen, orta ila geç L4 larvalarının immün lekeli distal tükürük bezinde incelendi.
Lümeni çevreleyen salgı hücrelerinin apikal etki alanları, mikrovilli gibi yapıları düşündüren yoğun Nil kırmızısı lekelemesine sahipti. Rab 11 lekesi apikal yüzeye yakın bir şekilde gözlendi. Zamanla ilgili tek bir adım var, o da soğuk asetondaki dokuların 90 saniyelik inkübasyonu.
Bu protokol daha yeni geliştirildi, ancak sivrisinek tükürük bezi üzerinde çalışan herkese yardımcı olacağını umuyoruz. Sık sık kullanmayı bekliyoruz.
