Apoptozun başlatılması, marker moleküler platformlarda kaspazların aktivasyonu ile aracılık eder. Caspase-8 aktivasyonu için bir platform görevi gören anahtar başlatma hücre ölüm kompleksi DISC'nin tespitini sunuyoruz. Bu tekniğin avantajı, bu komplekste kaspaz-8 işleme hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra montajın ve DISC kompleksinin bileşiminin algılanmasını sağlamasıdır.
Deneye% 80 ila% 90 birleştiği ve çanağa yapışan hücrelerle başlayın. Ortamı atın ve yapışık hücrelere taze ortam ekleyin. Daha sonra plakayı bir açıyla tutarak ve ligand'ı yapışık hücrelere dokunmadan ortama pipetleyerek hücreleri seçilen CD95L konsantrasyonu ile uyarın.
Hücreleri toplamak için hücre kabını buza yerleştirin. Hücre süspansiyonu içine 10 mililitre soğuk PBS ekleyin ve ekli hücreleri plakadan kazıyın. Hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Hücre kabını 10 mililitre soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve yıkama çözeltisini aynı 50 mililitrelik tüpe ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonu 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Üstnatant attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre soğuk PBS'de yeniden depola.
Daha sonra hücre süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonu santrifüj ve tekrar soğuk PBS bir mililitre hücre pelet resuspend. Santrifüjü bir kez daha tekrarlayın, ardından hücre peletini bir mililitrelik lizis tamponunda yeniden ıslatın ve buzda 30 dakika kuluçkaya bırakın.
Kuluçkadan sonra, lisatı dört santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin, ardından süpernatantı temiz bir tüpe aktarın. Peletin atılması ve protein konsantrasyonunun belirlenmesi için başka bir tüpte 50 mikroliterlik bir lysate örneği toplayın. İmmün önkseçim için, iki mikrolitre anti-APO1 antikoru ve 10 mikrolitre hazırlanmış Protein A Sepharose boncuklarını lisate ekleyin.
Boncuk kontrolü görevi görmek için lysate içeren ayrı bir tüpe sadece boncukların 10 mikrolitresini ekleyin. Lysate, antikorlar ve Protein A Sepharose boncuklarını içeren karışımı hafif karıştırma ile dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, karışımı dört santigrat derecede dört dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.
Süpernatantı attıktan sonra, bir mililitre soğuk PBS ekleyerek ve santrifüjü takiben süpernatantı atarak boncukları yıkayın. Bu adımı en az üç kez tekrarlayın. Son PBS yıkamayı attıktan sonra, boncukları tercihen 50 mikroliter Hamilton şırıngası ile aspire edin.
Batı lekesini gerçekleştirmek için boncuklara 20 mikrolitre 4X yükleme tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Aynı anda, lisat kontrollerini 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Lysates, immün önkupitantlar ve bir protein standardını %12,5 SDS jeline yükleyin ve 80 volt sabit voltajla çalıştırın.
Jel çalışması tamamlandıktan sonra, proteinleri SDS jelinden nitroselüloz bir zara aktarın. Aktarım tamamlandıktan sonra, şişmiş zarı bir kutuya yerleştirin ve nazik ajitasyon altında blokaj çözeltisinde bir saat kuluçkaya yatırın, ardından membranı PBST ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Proteinleri tespit etmek için, belirtilen seyreltmedeki ilk birincil antikoru zara ekleyin ve hafif ajitasyonla dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya bırakın.
Ertesi gün, zarı üç beş dakikalık PBST yıkama ile yıkayın, ardından membranı oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallanarak 20 mililitre ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Membranı pbst ile tekrar üç kez yıkayın. Son PBST yıkamasını attıktan sonra, zara yaklaşık bir mililitre yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin ve kemomünsans sinyalini algılayın.
Serviks kanseri HeLa-CD95 hücrelerinin CD95L ile uyarılması, CD95 immün önkekipitasyon yoluyla izlenen yüksek düzeyde CD95 DISC oluşumuna neden oldu. Bu CD95 immünopipitasyonlarında etkili DISC oluşumunu gösteren CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ve c-FLIPS gözlenmiştir. İmmün önkupitasyonlarda p43-FLIP ve p22-FLIP'in kaspaz-8 aktivasyonunu gösteren dekolteli ürünleri tespit edildi.
CD95 DISC oluşumunun analizi için c-FLIP uzun uzun uzun ifade eden HeLa-CD95 hücreleri kullanılmıştır. Ebeveyn HeLa-CD95 hücrelerine benzer şekilde, CD95L tedavisi olmayan bu hücrelerden immün önkupitasyonlarda FADD, procaspase-9, procaspase-10, c-FLIP proteinleri ve PARP1 alımı saptanmamıştır. Aktif primer T hücreleri anti-CD95 immünöteniasyonlarda yüksek düzeyde CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ve c-FLIPS ile karakterize edildi.
Bu teknik, DISC'de caspase-8'in işlenmesi de dahil olmak üzere moleküler DISC oluşumunun analizini sağlar. Tüm yıkama adımları çok önemlidir. Ayrıca stimülasyon noktaları ve kuluçka süreleri de ciddiye alınmalıdır.
Disc kompleksindeki derlemeyi ölçmenin tek yolu budur. Bununla birlikte, caspase-8 aktivasyonunu ölçmek için, caspase-8 aktivite tahlilleri de uygulanabilir. Bu yaklaşım, apoptozun başlatılması hakkında yeni içgörüler elde etmemizi sağladı.
