Akış sitometrisi, tek hücrelerin multiparametrik analizine izin veren güçlü bir tekniktir. Milyonlarca hücreyi analiz ederek erken ve geç apoptozun biyobelirteçlerini doğru ve hızlı bir şekilde tanımlayabilir. Çoklu hücre molekülleri boyanır ve aynı anda tespit edilir.
Özellikle, tezgah üstü akış sitometrisi, uzman olmayan akış sitometristleri tarafından analiz ve yorumlamaya izin verir. Prosedürü gösteren, D vitamini kanser grubundan yüksek lisans öğrencisi Esther Zhou olacak. Hücre kültürlerini nemlendirilmiş bir CO2 ortamında% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede büyüterek başlayın.
Deneyler için hücreleri geçirmeden önce hücre kültürünün ana şişede yaklaşık% 70 oranında birleştiğinden emin olun. Ortamı şişeden çıkarın ve hücreleri 1X PBS ile yıkayın. Daha sonra hücreleri ayırmak için bir mililitre tripsin ekleyin.
Hücreler ayrılmaya başladıktan sonra, hücreleri saymadan önce% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmiş yaklaşık beş mililitre taze kültür ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin. Altı kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında üç mililitre hücre kültürü ortamında mililitre başına 15.000 hücrede tohum hücreleri. Hücrelerin kuyunun dibine yapışmasını sağlamak için kültür plakalarını gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 CO2 ile inkübe edin.
Ertesi gün, deneysel kültürleri mililitre aktinomisin D başına 100 nanogram ve ortam ve çözücü kontrolleri ile sırasıyla taze kültür ortamı ve DMSO ile 24 saat boyunca tedavi edin. Ortamı kuyucuklardan çıkarın ve harcanan ortamı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Hücreleri 1X PBS ile yıkayın.
Hücreleri ayırmak için 500 mikrolitre tripsin ekleyin. Hala kuyunun dibine bağlı kalan hücreleri mekanik olarak yerinden çıkarmak için bir mililitre orta iki ila üç kez yavaşça geri pipet yapın. Çözeltiyi kuyucuklardan 15 mililitrelik bir tüpe ekleyin ve ardından tripsini nötralize etmek için beş mililitre taze kültür ortamı ekleyin.
Bir mikrosantrifüj tüpünde DNA bağlayıcı boyalar içeren 450 mikrolitre reaktif. Mikrosantrifüj tüpüne 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.
Hücreleri akış sitometrisi ile numaralandırın. Apoptoz tahlillerine geçmeden önce tüm numuneleri, hücre kültürü ortamı ile mililitre başına 10 ila altıncı hücrelerin bir katı konsantrasyonuna kadar seyreltin. Bir ek V kullanarak fosfatidilserinin dışsallaştırılmasını tespit etmek için, bir mikrosantrifüj tüpüne 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Buna, 1: 1 floresan konjuge ek V ve 7-AAD reaktifinin 1: 1 karışımından 100 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin, ışıktan korunun. Mitokondriyal membran depolarizasyonunun analizi için, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj ederek başlayın ve ardından süpernatanı atın.
Hücreleri bir mililitre 1X PBS'de yeniden askıya alın. Her numuneye 100 mikrolitre TMRE boyama çözeltisi ekleyin ve süspansiyonu nazik geri pipetleme ile karıştırın. Numuneleri ışıktan korumak için temiz alüminyum folyoya sarın ve hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir CO2 ortamında 20 dakika boyunca inkübe edin.
İnkübasyonun sonunda, numuneye 7-AAD çalışma çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Aktif terminal kaspaz-3 ve 7'yi tespit etmek için, DMSO'daki DEVE'ye bağlı DNA bağlayıcı peptidi, kaspaz algılama çalışma çözeltisini yapmak için steril 1X PBS ile 1: 8 oranına seyrelterek başlayın. Çözeltiyi buz üzerinde saklayın veya ışıktan korunan iki ila sekiz santigrat derece ekleyin.
7-AAD çalışma çözümünü oluşturmak için 148 mikrolitre 1X PBS'ye iki mikrolitre 7-AAD stok çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi buz üzerinde veya ışıktan korunan iki ila sekiz santigrat derecede saklayın. Hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini 300 kez G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Hücreleri 50 mikrolitre 1X PBS'de yeniden askıya alın, ardından beş mikrolitre kaspaz algılama çalışma çözeltisi izleyin ve iyice karıştırın. Tüplerin kapağını gevşetin ve ışıktan korunmuş, 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir CO2 ortamında 30 dakika boyunca inkübe edin. Her numuneye 150 mikrolitre 7-AAD çalışma çözeltisi ekleyin ve karıştırın.
Işıktan korunan oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Çift sarmallı DNA kırılmalarının ve toplam DNA hasarının tespiti için, önce hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini 300 kez G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücreleri 500 mikrolitre 1X PBS'de yeniden askıya alın ve 500 mikrolitre formaldehit bazlı bir fiksasyon tamponu ekleyin ve karıştırın.
Örnekleri buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. 300 kez G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Hücreleri bir mikrosantrifüj tüpünde 90 mikrolitre 1X PBS'de yeniden askıya alın.
Mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 100 mikrolitre 1X PBS ekleyin ve 300 kez beş dakika boyunca santrifüj yapın G.Süpernatantı atın ve hücreleri 200 mikrolitre 1X PBS'de yeniden askıya alın.
Numuneyi akış sitometresine yüklemeden önce numuneyi nazikçe geri pipetleyerek karıştırın. Cihazın sistem kontrol kitini çalıştırarak akış sitometresinin analitik performansını doğrulayın ve tüm kontroller tamamlanıp geçene kadar numuneleri çalıştırmaya devam etmeyin. İlk olarak, akış sitometresine negatif bir kontrol örneği yükleyin ve cihazın numuneyi aspire etmeye başlaması ve algılanan olayların gerçek zamanlı bir önizlemesini sağlaması için Çalıştır, Ayarları Ayarla'yı seçin.
Canlı önizlemeyi kullanarak floresan ve hücre boyutu için eşikleri ayarlayın. Hücre popülasyonunun etrafına dikdörtgen bir kapı çizin, hücresel kalıntıları dışlamak için eşik işaretleyicisini sürükleyin ve devam etmek için İleri, Apoptoz Profilini Ayarla'yı seçin. Hücre popülasyonlarını ayırmak ve algılanan olayları gerçek zamanlı olarak çizmek için kadran işaretçilerine dokunup sürükleyin.
Son kullanıcıyı kadran işaretleyicilerinin uygun şekilde yerleştirilmesi konusunda yönlendirmek için bu grafikleri kullanın. Enstrümanın ayarların bir özetini görüntülemesi için İleri, Ayarları Doğrula'yı seçin. Ayarları inceledikten sonra, bu ayarları denemedeki tüm örneklere uygulamak için İleri, Bitiş Ayarları'nı seçin.
İlk numuneyi nazikçe geri pipetleyerek karıştırın ve ilk numuneyi akış sitometresine yükleyin. İleri'yi seçin, ardından örneği adlandırın ve sistemin örneği çalıştırmaya başlaması için Çalıştır'ı seçin. Gerekirse, satın alma sonrası kapıların veya kadran işaretleyicilerinin ince ayarını yapın.
Sistemin dosya tarayıcısında gezinerek ayarlanması gereken denemeyi bulun ve denemeyi açın. Büyütmek için grafiğin küçük resim önizlemesine dokunun. Kadran işaretçilerini ayarlamak için, işaretçileri oldukları gibi hareket ettirmek üzere dikey ve yatay çizgilerin kesişimine tıklayın ve çizgiyi tıklatıp tutamacı sürükleyerek her iki çizginin açısını ayarlayın.
Hücre geçidini hassaslaştırmak için Kapı sekmesine tıklayın ve kapının boyutlarını ayarlayın. İşaretçileri istediğiniz gibi ayarlayın ve onay işareti simgesini seçip, tüm örnekleri işaretleyerek ve Kabul Et'i seçerek bu ayarları denemedeki tüm örneklere uygulayın. Testleri üçlü olarak çalıştırın ve örnekler ile kontroller arasındaki önemli farklılıkları değerlendirmek için post hoc Bonferroni testi ile bir varyans analizi çalıştırın.
Hücre sayısı ve canlılık sonuçları, örneklemdeki hücrelerin% 95.2'sinin canlı ve% 4.8'inin ölü olduğunu göstermiştir. Hücre konsantrasyonunun mililitre başına 5.90 kez 105 hücre olduğu bulundu. Ek V ve hücre ölümü testi, kontrollere kıyasla, mililitre aktinomisin D başına 100 nanogram ile tedavi edilen SiHa hücrelerinde apoptotik hücrelerde önemli bir artış göstermiştir.
Mitokondriyal elektrokimyasal transmembran potansiyel testi, aktinomisin-D, orta kontrol ve çözücü kontrolü arasındaki hücre sağlığı profillerinde önemli bir azalma olduğunu göstermiştir; bu, mililitre aktinomisin D başına 100 nanogramın SiHa hücrelerinde mitokondriyal depolarizasyonu indüklediğini göstermiştir. Kaspaz-3 ve 7 testi, kontrollere kıyasla, mililitre aktinomisin D başına 100 nanogram ile tedavi edilen SiHa hücrelerinde terminal kaspazların önemli aktivasyonunu göstermiştir. Aktinomisin D, DNA hasar belirteçlerini, ATM'yi ve H2A'yı önemli ölçüde indükledi.
SiHa hücrelerinde X, DNA hasarında önemli bir artış olduğunu öne sürdü. Doğruluğu artırmak için, toplam hücre popülasyonunu topladığınızdan emin olun. Ayrıca, üreticinin önerdiği hücre konsantrasyonlarına ve boyama sürelerine uyun.
Lekeli numunelerin ışıktan korunması, fotobeyazlatma veya floroforları önler. Apoptozun akım sitometrisi ile biyokimyasal analizi mikroskopi ile desteklenmelidir. Bu, klasik apoptozun morfolojik özelliklerini tanımlayacaktır.
Özellikler arasında nükleer yoğuşma, hücre zarı karıştırma, apoptotik cisimler ve karyorrhexis bulunur.
