Retinopatilerde vasküler değişiklikler klinisyenler tarafından tespit edilen ilk işarettir. Hastalığın ilerlemesini takip ederler ve bu değişikliklere göre bir tedavi seçerler. Patolojinin farklı aşamalarını incelemek için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir.
Bu çalışmada, farklı vasküler değişikliklerin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bunun için iki hayvan modeli çalıştıracağız. Bunlardan biri, prematüritenin retinopatisini ve proliferatif diyabetik retinopatinin bazı yönlerini yeniden üreten Oksijen Kaynaklı Retinopati fare modelidir.
Burada, avasküler alanları, neovasküler alanları ve arteriyolların genişlemesini ve tortuositesini ölçeceğiz. Laboratuvarımızda, üretken olmayan bir retinopatiye neden olan metabolik sendromlu bir fare modeli geliştirilmiştir. Bu çalışmada damar yoğunluğu ve dallanma değerlendirildi.
Farelerin kurban vermesi üzerine makasla enükleatize edin. Enükle olmuş gözleri oda sıcaklığında bir saat boyunca taze hazırlanmış paraformaldehit ile sabitlayın. Diseksiyon mikroskobu altında, limbüs boyunca keserek korneaları makasla çıkarın ve tüm retinaları parçalara çıkarın.
Gözün ön kısmını atın ve retinayı RPE-choroid'den ayırın. Retinaları 200 mikroliter tüpe yerleştirin. Daha sonra retinaları 100 mikrolitre TBS'de bloke edin ve permeabilize edin% 5 sığır serum albümin Triton altı saat boyunca dört derecede shaker nazik ajitasyon ile.
Daha sonra retinayı bardağa yerleştirmek için tüpü ters çevirin ve engelleme solüsyonını pipetle çıkarın. İzoliktin içeren 100 mikroliter çözeltisi ekleyin. Numuneleri ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile sarın.
Retinaları lektin çözeltisi ile bir gecede dört derecede çalkalayıcıda hafif ajitasyon ile kuluçkaya yatırın. Retinaları 100 mikrolitre TBS-Triton ile çalkalayıcıda hafif ajitasyonla 20 dakika yıkayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
Retinayı bir slayda yerleştirin ve bir damla PBS ekleyin. Mikroskobun diseksiyon altında, retinanın kenarlarından optik sinire doğru eşit derecede uzak dört kesik gerçekleştirin. Retinanın yapraklarını açılmak için, tokmaklar veya küçük filtre kağıdı parçaları kullanın.
Fotoreceptör tarafının aşağı dönük olduğundan emin olun. Kalan PBS'yi filtre kağıdıyla slayttan çıkarın. Ardından bir montaj ortancası ve kapak kılıfı ekleyin.
Oda sıcaklığında bir saat kurumasına izin verin. Slaytları ışıktan korunan dört derecede saklayın. Konfokal mikroskopta, slaydı plakaya yüzüstü yerleştirin.
Retinal vaskülatın üstün pleksusunun odaklanması ve görüntü alımını başlatmak için bir alan seçin. Yazılımda genel lazer parametrelerini ayarlayın. Koordinatları X, Y ve Z eksenlerinde ayarlayın.
Taramayı başlatın. Tarama işlemi tamamlandıktan sonra görüntüyü açın ve tercih edilen bir uzantıyla kaydedin. ImageJ FIJI yazılımında, Menü Çubuğu'na gidin ve Dosya, Aç'ı tıklatın.
İşlenmek üzere görüntüyü seçin. Biyo-Biçimler İçe Aktarma Seçeneği penceresinde, OME-XML Meta Verilerini Görüntüle'yi seçin ve OME Meta Verileri penceresinin OK.In tıklatarak piksel boyutu bilgilerini arayın. Bu verileri kopyalayın.
Görüntü kalibrasyonu için Menü Çubuğu'na gidin ve Görüntü Özellikleri'ni seçin. Bilgileri kopyalayın ve Tamam'ı tıklatın. Görüntüye tercih edilen bir lut atayın. Tüm yığını tek bir görüntüde görselleştirmek için Menü Çubuğu'na gidin ve Görüntü, Yığınlar, Z Projesi'ni seçin.
Görüntülenen projeksiyon penceresinde, gemilerin görselleştirildiği tüm yığınları seçin. Projeksiyon Türü'nde Ortalama Yoğunluk'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Menü Çubuğu, Görüntü, Ayarla, Parlaklık/Kontrast'a gidin. Uygula'yı tıklatın ve değişiklikleri kaydedin.
Parlaklık ve kontrast için seçilen parametreleri kopyalayın. Bunlar tüm görüntüler için aynı olmalıdır. Menü Çubuğu'nda Asa aracını seçin.
Oluşan damarlardan yoksun retina bölgesini seçin. Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde seçili alanları kaydetmek için klavyede T tuşuna basın. Araç alanı bilgilerini edinmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde Ölçül'ü tıklatın.
Retinanın toplam alanını ölçmek için bu adımları tekrarlayın. Menü Çubuğu'nda Asa aracını seçin. Neovesselleri daha iyi görselleştirmek için görüntüyü yakınlaştırın.
Asa aracı ile neovesselleri tek tek seçin. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Alan verilerini elde etmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde Ölçü'nün üzerine gelenleri tıklatın.
Menü Çubuğu'nda Düz Çizgi aracını seçin. Damar duvarını daha iyi görselleştirmek için görüntüyü yakınlaştırın. İlk daldan önce ana damara üç transversal hat gerçekleştirin.
Seçili alanları yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyede T tuşuna basın. Mesafe verilerini elde etmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde Ölç'ü tıklatın. Menü Çubuğu'nda, farenin sağ düğmesiyle Düz Çizgi aracı simgesini tıklatın ve Parçalı Çizgi'yi seçin.
Damar şeklini takip ederek, ilk damar çarpmasına kadar optik sinirden damarın içine bir çizgi çizin. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Menü Çubuğu'nda Düz Çizgi aracını seçin.
optik sinirden ilk damar çarpmasına kadar bir çizgi çekin. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Mesafe verilerini elde etmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'ndeki Ölçü'nün üzerine gelenleri tıklatın.
Menü Çubuğu'nun Oval aracıyla, tüm deneysel koşullara eşit olarak uygulanan bir alan tanımlayın. Seçilen alan optik sinirin etrafına çizilmiş eşmerkezli bir daire olmalıdır. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın.
Manuel olarak, seçim alanının içindeki ana damarlardan kaynaklanan birincil dalların sayısını sayın. Görüntüyü 8 bit moda dönüştürün. Menü Çubuğundaki Eklentiler'e gidin, Gemi Analizi, Damar Yoğunluğu'nı seçin.
Menü Çubuğu'nun Kare aracıyla gemi yoğunluğunu ölçmek istediğiniz bir alan tanımlayın. Tamam'ı tıklatın. Program, gerekli bilgileri içeren yeni bir pencere görüntüler. İlk deneysel örnekte Oksijen Kaynaklı Retinopati fare modeli kullanıldı.
İntravitreal enjeksiyonlar 12. Araç enjekte edilen fareler kontrol olarak kullanıldı. Avasküler alanlar retina kan damarlarından yoksun bölgeler olarak tanımlanır.
Elde edilen görüntülerden, avasküler alanlar, damarları olmayan bölgelerin toplamı retinanın toplam alanını böldüğü için ölçülebilir. Mekanik hasar alan alanlar da damar yokluğu gösterir. Hasarlı bölgeleri tanımlamak için Hoechst lekesi ile nöronal tabakaların bütünlüğünü analiz edin.
Neovesseller, üstün vasküler pleksusların önceden var olan damarlarından kaynaklanan küçük kalibreli kaplardır. Neovessels'tuftların kapladığı alanı, retinanın toplam alanı olan retinanın neovasküler alanını ölçerek hesapladık. Neovessellerin şekli ve boyutu değişken olduğundan, bazen enkaz ve eserlere benzer görünebilirler.
Neovesselleri ayırt etmek için, tutamın olgun bir damardan büyüdüğünü doğrulayın. Dilatasyonun analizi için ilk daldan önce ana damar çapını üç yükseklikte ölçtük. Araştırmacılar, sonuçlar arasındaki değişkenliği azaltmak için damar çaplarını ölçmek için önceden belirlenmiş bir mesafe tanımlamalıdır.
İdeal olarak, optik sinirden en uzak nokta yaklaşık 300 mikrometre olmalıdır. Analizi ve daha sonra durum başına ortalama en az altı hayvan yapmayı öneriyoruz. İşkence ile ilgili olarak, ana damarın şeklini takip ederek kat ettiği mesafeyi, optik sinir ile ilk dallanma noktası arasındaki düz çizgi mesafesine göre ölçüyoruz.
Görüntüde gördüğümüz gibi, ana damarların sinüslüğünde heterojenlik vardır. Temsili bir sonuç elde etmek için, durum başına altı fareden az olmamak üzere ölçülmelidir. Proliferatif olmayan retinopati sergileyen metabolik sendrom modelinde en son parametreler, damar dallanma ve yoğunluk analiz edildi.
Vasküler dallanmanın ölçümü için eşmerkezli bir daire çizerek nicelik alanını tanımladık ve daha sonra ana merkezi bir damardan kaynaklanan birincil dalları tek tek saydık. Elde edilen görüntülerden, damar yoğunluğu, her mikrofotoğrafçıda farklı yerlere konumlandırılmış olan yatırım getirisinin alanına bölünen damarların kapladığı alan olarak ölçüldü. Mekanik hasara sahip alanları ölçmekten kaçının.
Delinmiş ikiden fazla alan varsa, retina atılmalıdır. Özetle, bu makalede, klinik uygulamada dikkate alarak en alakalı parametrelerden bazılarını ölçmek için klasik, köklü ve tekrarlanabilir teknikler gösterdik.
