Bu metodoloji, tutarlı Raman görüntülemeyi kullanarak topikal olarak uygulanan ilaç ürünlerini ölçmek için tekrarlanabilir ve doğru bir yönteme izin vermesi bakımından önemlidir. Diğer metodolojiler hacimli kutanöz farmakokinetik bilgi sağlarken, bu metodoloji bir ilacın geçirgenlik yolu gibi hem toplu hem de mikro ölçekli kutanöz farmakokinetik bilgiler sağlayabilir. Görselleştirme, nicelleştirme ve geçirgenlik yolları, hedef bölgeye ulaşmak için belirli bir yol göz önünde bulundurularak ilaç ürünlerinin geliştirilmesine izin verecektir.
Doku hazırlama bu metodolojinin en zorlu kısmı olduğunu kanıtlayacaktır. Doku yeterince ince olmalıdır, böylece cilt içinden okuyabilmelidir. Çıplak bir fare kulak derisi dokusunun hazırlanmasına başlamak için, ötenazi çıplak fareler alın ve forseps ve mikrocerrahi makas kullanarak farenin kulaklarını çıkarın.
Sonra bir kulağı 60 milimetre x 15 milimetre büyüklüğünde büyük bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, fare kulağını PBS ile iki kez durulayın ve görev sileceği ile her seferinde kulağı kurutun. 24 saat içinde kullanılırsa, kulağı PBS'ye iki ila sekiz santigrat derecede küçük, 35 milimetre x 10 milimetre Petri kabına yerleştirin.
Hasattan 24 saat sonra kullanmak için, kulağı PBS'siz bir Petri kabına yerleştirin, ardından kabı eksi 20 santigrat derecede bir dondurucuda saklamak için parafilmle örtün. Biyolojik kaputun altında çalışırken, insan derisi dokusunu, stratum korneum tarafı aşağıya bakacak şekilde büyük bir Petri kabına yerleştirin, böylece deri altı yağına erişilebilir. Daha sonra deri altı yağını çıkarmak için forseps ve mikrocerrahi makas kullanın.
Subkutan yağ artık makasla çıkarılamadığında, cildi hala forsepslerle tutarken kalan deri altı yağını çıkarmak için cilde 45 derecelik bir açıyla 10 bıçaklı tek kullanımlık bir neşter kullanın. Yağ alındığında, insan derisini bir santimetre parça halinde bir santimetreye bölün. Lipid görüntüleme için, fare kulağının ön kısmını 35 milimetrelik, sıfır numaralı bir kabın cam tabanına bakacak şekilde yerleştirin.
İnsan derisi için, yüzeyselden daha derin katmanlara ilaç miktarının belirlenmesine izin vermek için cildi stratum korneum aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Doku cam tabana ortalandıktan sonra, cildin düz olduğundan ve cam alt kabın kapak kayma yüzeyi ile tam temas ettiğinden emin olmak için bir pamuk ucu aplikatörü kullanın. Görüntüleme sırasında herhangi bir hareketi önlemek için, cildin üstüne bir yıkayıcı yerleştirin ve Uyarılmış Raman Saçılması veya SRS iletim algılaması için dokunun yıkayıcının orta deliğinden görülebildiğinden emin olun.
Formülasyonun önceden belirlenmiş dozunu cilde pipetleyin, ardından formülü 30 saniye boyunca saat yönünde ovalamak için eldivenli bir parmak kullanın. Formülasyonun nüfuz etmesi için ayrılan süre geçtikten sonra, cildi formülasyon tarafı cam alt kaba bakacak şekilde yerleştirmeden önce fazla formülasyondan çıkarın. Ardından, Mikroskop Kontrolü veya MC yazılımını açarak deney düzeneğine geçin.
Göz merceğinden bakarak, dokunun odak içinde olduğundan emin olmak için ayar düğmesiyle eksenel odağı ayarlayın. İşiniz bittiğinde, hem pompanın hem de Stokes kirişlerinin blokajını kaldırın ve ALG1 ve ALG2 kanallarının etkinleştirildiğini onaylayın. SRS fotodiyotunun kondenserin üzerinde konumda olduğundan emin olun, ardından cildi CARS ve SRS kanallarında görselleştirmek için MC yazılımında Focus x2'ye tıklayın.
Çok Alanlı Zaman Atlamalı veya MATL modülünde, Görünüm sekmesine gidin ve görüntüleme listesinin görünmesi için Kayıtlı Nokta Listesi'ne tıklayın. Stratum korneum tanımlandıktan sonra, spesifik doku tabakalaşmalarını tanımlamak için eksenel odak veya Z-odağı arasında kaydırın. Lipid ayarlı kontrast ile canlı görüntüleme sırasında belirlendiği gibi, stratum korneum, yağ bezleri, adipositler veya deri altı yağ gibi deriye spesifik derinlikler eklenebilir.
Bununla birlikte, tüm derinlik yığınları alınacaksa, XY konumları eklenebilir ve göreli Z konumu yok sayılabilir. Her cilt tabakalaşması için belirli bir derinliğin görüntülenmesi durumunda, MATL kuyruğuna eklemek için Kayıt Noktası'nı seçin. Tam derinlik yığınları için, Alma Parametreleri penceresinde Derinlik Seçimi ile Her XY Konumu için Kayıt Noktası'nı tıklatın.
Ardından, MATL modülünde yineleme sayısını bire ayarlayın ve Hazır'ı tıklatın. Oynat oku griden siyaha dönüştüğünde, ön lipit yığınını görüntülemeye başlamak için Oynat'a basın. Görüntüleme döngüsü tamamlandıktan sonra, hem pompayı hem de Stokes ışınlarını bloke edin ve lazer grafik kullanıcı arayüzündeki dalga boyunu, hedeflenen dalga sayısına veya Raman titreşimine bağlı olarak istenen dalga boyuna değiştirin.
Manuel zaman gecikme aşamasını ayarlarken, a priori olarak oluşturulan lipit ve aktif farmasötik bileşeni veya API'yi görüntülemek için aynı güçlerin kullanılmasını sağlayın. Toplam döngü tekrarı sayısı seçildikten sonra, pompa ışınının engelini kaldırın ve ayar noktalarının otomatik olarak görüntülenmesine başlamak için Oynat düğmesine basmadan önce fotodiyotu kullanarak gücün istenen güçle eşleşip eşleşmediğini kontrol edin. Ardından, bir yağ bezi lipit görüntüsünü Fiji'ye aktararak ve dosyayı CARS ve SRS kanallarına bölmek için Bölünmüş kanallar etiketli kutuyu işaretleyerek her cilt tabakalaşması için veri analizi gerçekleştirin.
İlgi Alanı veya YG Yöneticisi'ni açmak için Analiz, Araçlar ve YG Yöneticisi'ne tıklayın. SRS kanalını C'nin bire eşit olacağı şekilde kullanarak, görüntüdeki yağ bezinin işaretini kaldırın ve YG Yöneticisi'nde T Ekle'yi tıklatarak YG Yöneticisi'ne işaretleri ekleyin. İşlemi görüntüdeki her yağ bezi için tekrarlayın.
Lipid açısından zengin bölgeleri maskelemek için, her YG'yi seçin ve ardından Daha Fazla, VEYA Birleştir ve Sekmeler ekle'yi tıklatın. Lipid açısından zayıf bölgeleri maskelemek için Fiji menüsündeki Dikdörtgen Aracı'nı kullanın ve tüm görüntünün etrafına bir kare çizin. Bölgeyi YG Yöneticisi'ne ekleyin.
YG Yöneticisi'nde lipit açısından zengin tüm bölgeleri seçen YG'ye ek olarak yeni eklenen kare YG'ye tıklayın. Diğer altında, lipit açısından zayıf bölgelerin maskesini oluşturmak ve YG Yöneticisi'ne eklemek için XOR'u seçin. Görüntü, Yığınlar, Araçlar'a giderek görüntüleri sayısal sırada birleştirin ve sekmeleri sırayla birleştirin.
Alternatif olarak, görüntüleri Fiji'ye yükleyerek ve ardından kurulum sayfasında Benzer adlara sahip dosyaları gruplandır adlı bir seçenek belirleyerek içe aktarın. Birleştirilmiş görüntü etkinken, lipit açısından zengin bölgeleri seçmek için YG Yöneticisi'ne gidin ve Çoklu Ölçüm'ü seçmeden önce Diğer sekmesini tıklayın, ardından Sonuçlar penceresinin görünmesini bekleyin. Sonuçlar penceresinden, verileri bir elektronik tabloya dışa aktarın ve her veri satırına lipit bakımından zengin bölgeler eklemek için Bölge başlıklı bir sütun ekleyin.
Lipitlerin dışındaki bölgelere zayıf lipid ekleyin. Verileri görselleştirmek için elektronik tabloyu kaydedin ve ggplot2 R paketine aktarın. Ardından, konsantrasyon-zaman verilerini tahmin etmek için verileri görüntü numarasının bir fonksiyonu olarak ortalama yoğunluğa karşı çizin.
RStudio'da bölümlere ayırmayan analizi veya NCA'yı, elektronik tablodan içe aktarılan yoğunluk süresi verilerinde tek katman çağrısıyla çalıştırın. İşiniz bittiğinde, Jmax ve AUCflux-all metriklerini çizin ve görsel olarak karşılaştırın. Ek olarak, deneysel koşullar arasında istatistiksel karşılaştırmalar yapın.
Temsili analiz, stratum korneum, yağ bezleri, adipositler, çıplak fare kulak derisinden deri altı yağları ve stratum korneum, papiller dermis ve insan derisinden yağ bezini göstermektedir. Çıplak fare kulak derisinde yağ bezlerinin sınırlı doku hareketi, formülasyon uygulaması sırasında ve uygulamadan 120 dakika sonra bezlerin aynı doku derinliği ile gözlenmiştir. Derideki önemli doku hareketi, 120 dakikalık ilaç uygulamasından sonra zar zor görülebilen yağ bezleri gösterdi ve orijinal protokolün verimsizliğini gösterdi.
Çeşitli çalışmalarda, zamana karşı yoğunluk profilleri yüksek başlangıç konsantrasyonları gösterdi, ardından konsantrasyonları azaltarak ilacın dokuya daha fazla emilmediğini gösterdi. Öte yandan, bazı çalışmalar, daha sonra deneysel süre boyunca azalan yoğunluklarda bir artış olduğunu ve dokuya akışın görüntülemeden önce maksimuma ulaşmadığını göstermiştir. Aynı API için iki formülasyonun konsantrasyon-zaman profillerinin NCA analizi, etoksi-etoksietanolün, cilt tabakasından bağımsız olarak jel formülasyonuna kıyasla genişletilmiş API geçirgenliği sağladığını göstermiştir.
Aynı formülasyonlar arasındaki toplam maruz kalma analizi, cildin daha derin katmanlarında benzer gözlemler sergiledi. İlaç uygulamasından sonra insan derisinin hazırlanması ve cam alt kabın üzerine uygun cilt yerleştirilmesi, deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir. Buradaki açık çözümler bu metodolojinin uygunluğunu göstermiştir.
Daha fazla araştırma, formülasyonun API penetrasyonunu ve geçirgenliğini nasıl etkilediğini anlamak için kremler gibi pazarlanan formülasyonları içerecektir.
