Esnek çevre odası tekniği, bir çalışma mikroskobu çerçevesi üzerinde iletilen sinyal algılama ile SRS görüntüleme olarak hızlandırılmış çekim sağlar. SRS mikroskopisi, yüksek sayısal açıklıklı bir hedef ve yüksek uçlu bir kondenser kullandı ve geleneksel bir odanın sığamayacağı yerlerde sadece birkaç milimetre boşluk bıraktı. Esnek bir oda bu sorunu çözer.
SRS mikroskobu kullanan araştırmacılar bu tekniği kolayca benimseyebilirler. Esnek oda, numuneyi optimum fizyolojik koşullar altında tutmak için diseksiyon veya steril mikroskopta da kullanılabilir. Başlamak için, SRS mikroskop çerçevesinin ayaklarının yerlerini ve motorlu sahneyi optik masadaki bir işaretleyici kalem kullanarak işaretleyin.
Mikroskop çerçevesini ve aşamasını optik masadan çıkardıktan sonra, silikon kauçuk tabakayı masanın üzerine yerleştirin. Silikon kauçuğu bir bıçak kullanarak işaretler boyunca kesin. Küçük kauçuk parçaları çıkarın ve kare mika seramik levhaları aynı yerlere yerleştirin.
Ardından mikroskop çerçevesini ve sahneyi optik masaya geri getirin ve ayakları işaretleyici çizgileri boyunca mika seramik tabakalara dikkatlice hizalayın. SRS optik yolunu yeniden hizaladıktan sonra, beş parça büyük polikarbonat levha kullanarak, tüm mikroskop çerçevesini kaplamak için çevresel muhafazayı ısı yalıtım temelinin üzerine monte edin. Alüminyum folyo bant kullanarak kutunun kenarlarını ve arayüzlerini kapatın.
Isıtıcı modülü tarafından pompalanan ve kontrol edilen sirkülasyonlu, sıcak hava akışına izin vermek için esnek kanal hortumunu muhafaza kutusunun giriş ve çıkış portlarına bağlayın. İşlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 1'i, üç set vidası kullanarak hedefin burun parçasına monte edin. Daha sonra, işlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 2'yi dört vida kullanarak numune tutucuya monte edin.
Alüminyum parça 2'li numune tutucuyu motorlu sahneye takın ve vidalar kullanarak monte edin. Doğal kauçuk film manşonunu işlenmiş iki alüminyum parça arasına yerleştirin ve her iki ucunda lastik bantlar kullanarak monte edin. Sıkıştırılmış CO2 tüpünü uygun boru ve konektörleri kullanarak gaz karıştırıcı modülüne bağlayın.
CO2 giriş basıncını 20 ila 25 psi olarak ayarlayın. Hava karıştırıcı modülünün %5 CO2'yi düzenleyebildiğinden ve hava akışına karıştırabildiğinden emin olmak için dahili CO2 sensörünü ve bir kontrolörü kullanın. Hava akışını temizlemek için hat içi filtreler kullanın.
Uygun boru ve konektörleri kullanarak, karışık havayı ocak plakasına yerleştirilen önceden sterilize edilmiş su şişesine yönlendirin ve ardından nemlendirilmiş havayı esnek odaya yönlendirin. Ocakçığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Hava akışının nemini artırmak için ılık sudaki hava akışını kabarcıklandırın.
Vidaları sökerek makinenin alüminyum parça 2'sini numune tutucudan ayırın. Burun parçası, numune tutucu ve suya daldırma hedefi dahil olmak üzere esnek haznenin tüm parçalarını %70 etanol ile silin. Muhafazaya yerleştirilmiş bir UV lambası kullanarak 20 ila 30 dakika boyunca tüm muhafaza sistemini dekontamine edin.
Sonra hücre kültürü kabını yükleyin. Çanağın kapağını çıkarın ve kelepçeleri kullanarak hareketsiz hale getirin. Kaba odaklama için hedefi hücre kültürü ortamına indirin.
Esnek hazneyi kapatmak için alüminyum parça 2'yi indirin ve vidaları kullanarak numune tutucuya monte edin. Ardından sensörü takın. Normal hücre kültürü için hava beslemesini% 5 CO2 ve% 19 O2 ile dakikada 200 santimetreküp hava akış hızına ve sıcaklığa 37 santigrat dereceye kadar ayarlayın.
CH2 kimyasal bağlarının titreşimine atfedilen 2.854 santimetre ters Raman kaymasını hedeflemek için lazer dalga boyunu 805 nanometreye ayarlayın. Hücrelere verilen fotoğraf hasarını azaltmak için düşük lazer gücü kullanın. Yazılımın ana kontrol panelindeki odak düğmesini kullanarak hücrelerin iyi SRS görüntülemesini elde etmek için hedefi ayarlayın ve odaklayın.
Hızlı odaklama gerçekleştirmek için yapılandırma panelinde piksel bekleme süresi 4,8 mikrosaniye olacak şekilde piksel sayısını 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. İyi odaklama elde ettikten sonra, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için görüntüleme çözünürlüğünü 175 mikrometre karelik bir görüş alanı için 2048 x 2048 piksel olarak ayarlayın. Ana kontroller panelindeki kaydet işlevini kontrol edin ve kanallar panelindeki SRS kanalını kontrol edin.
İki kare arasındaki aralık süresini ana kontroller kanalında 180 saniye olarak ayarlayın. 24 saat boyunca hızlandırılmış görüntüleme için edinme numarasını 480 olarak ayarlayın. Ana kontrol panelindeki döngü işlevini kullanarak otomatik görüntüleme alımını başlatın.
Esnek kamara sisteminin hızlandırılmış SRS görüntüleme için performansı değerlendirildi. Mikroskop çevre muhafazasının içindeki sıcaklık beklenen 37 santigrat dereceye ulaştı ve oda sıcaklığını önemli ölçüde etkilemedi. Esnek odadaki sıcaklık 1,5 saatte 37 santigrat dereceye ulaştı ve en az 24 saat boyunca istikrarlı bir şekilde muhafaza edildi.
Esnek odadaki bağıl nem bir saat içinde% 85'e ulaştı ve en az 24 saat boyunca korunabildi. Canlı SKOV3 hücrelerinin hızlandırılmış SRS görüntülemesi, hücre içi lipit damlacıklarının hızlı ve aktif hareketini üç dakikalık bir zamansal çözünürlükle gösterdi. 24 saatlik görüntüleme seansının sonunda, hücreler hala normal morfoloji ve yoğunluk gösterdi ve bu da hücrelerin sağlıklı olduğunu gösterdi.
Daha sonra, oleik asit ile tedavi edilen SKOV3 hücreleri görüntülendi ve lipit damlacık birikimi 10 saat boyunca izlendi. Lipid damlacık miktarları, lipid damlacığı / hücre vücut alanı oranı ve lipid damlacıklarının toplam SRS yoğunluğu kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, lipit damlacıklarının miktarının 10 saat boyunca artmaya devam ettiğini göstermektedir.
Lipid damlacıklarının eşzamanlı ileri SRS görüntülemesi ve floresan boya DND-189 ile etiketlenmiş lizozomların geriye doğru iki foton floresan görüntülemesi de gösterilmiştir. Lipid damlacıklarının ve lizozomların çok düşük derecede kolokalizasyonu gözlendi. Bu protokolü denerken, fokal sürüklenmenin canlı hücre görüntülemede yaygın bir sorun olduğunu unutmayın.
Yaklaşık iki saatlik hızlandırılmış görüntülemeden sonra yeniden odaklama gerekebilir. Geliştirilmesinden sonra, hızlandırılmış SRS görüntüleme, canlı hücrelerde etiketsiz molekülleri veya Raman metni ile etiketlenmiş molekülleri izlemek için çeşitli çalışmalar için kullanılmıştır.
