Optogenetik, tipik indükleyicilere kıyasla çeşitli kimyasalların ve proteinlerin daha yüksek titrelerini elde etmek için kullanılmıştır. Bu protokolü kullanarak, diğerleri ışık tabanlı kontrol ile kendi süreçlerini geliştirebilirler. Optogenetik kontrol noninvaziv, yüksek oranda ayarlanabilir ve geri dönüşümlüdür.
Bu nitelikler, mikrobiyal süreçlerin kolaylaştırılmış bir optimizasyonuna izin verir ve hatta üç fazlı fermantasyonlar ve çok renkli kontrol gibi benzersiz fırsatlar sunar. Herhangi bir yeni kimyasal için, optimum ışık koşulları farklı olacaktır. Bu nedenle, bu protokoldeki parametreler kullanılarak düşük üretim gözlenirse, farklı ışık koşulları test edilmelidir.
OptoINVRT plazmidleri için gerekli bir belirteç olan HIS3 oksitrofisi ile bir Saccharomyces cerevisiae suşu elde ederek başlayın. Saccharomyces cerevisiae'ye özgü bir geni kontrol etmeye çalışıyorsanız, devam etmeden önce genin endojen kopyasının silindiğinden emin olun. Gerinim yapısına başlamak için, EZL439 gibi OptoINVRT7 devresini içeren plazmidi doğrusallaştırın.
PIGA bir promotörün ışıkta bastırılması ve karanlıkta etkinleştirilmesi için bileşenleri içeren EZL439 kullanıyorsanız, Pme1 kısıtlama bölgesinde doğrusallaştırın. Standart lityum asetat dönüşüm yöntemlerini kullanarak, plazmidi bir HIS3 oksotrofik suşa entegre edin. Dönüşümü takiben, hücreleri bir dakika boyunca 150 G'de santrifüj edin.
Hücreleri 200 mikrolitre taze SC-HIS ortamında nazikçe yeniden askıya alın. Tüm hücre hacmini bir SC-HIS agar plakasına yerleştirin ve koloniler ortaya çıkana kadar iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Standart lityum asetat dönüşüm protokollerini kullanarak yetkin hücreler hazırlayın.
PIGA1M veya PIGA1S promotörlerinin aşağı akışını optogenetik olarak kontrol etmek istediğiniz genleri içeren plazmid ile hücreleri dönüştürün. Transformasyondan sonra, kültürü bir dakika boyunca 150 G'de santrifüj edin ve hücre peletini 200 mikrolitre taze SC bırakma ortamında nazikçe yeniden askıya alın. Bir maya ekstraktı pepton dekstroz agar plakası üzerindeki tüm hücre hacmini, Delta bölgelerine entegre edilirse veya bir seçim işaretleyicisi içeren bir plazmid ile dönüştürülürse bir SC bırakma plakasını plakalayın.
Optogenetik olarak kontrol edilen geni bastırmak için hücreleri sabit mavi ışık altında 16 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. 465 nanometre dalga boyundaki herhangi bir ışık kaynağını kullanın ve ışık yoğunluğu saniyede metrekare başına yaklaşık 80 ila 110 mikromol olacak şekilde plakanın yaklaşık 40 santimetre üzerine bir LED panel yerleştirin. Bir kuantum ölçer kullanarak yoğunluğu ölçün.
Delta bölgelerine entegre ediliyorsa, plakayı, çeşitli entegrasyon kopya numaralarını seçmek için mililitre başına 400 mikrogram ile mililitre başına 1.200 mikrogram arasında bir dizi Zeocin konsantrasyonu içeren maya özü pepton dekstroz plakaları üzerine çoğaltın. Kopya plakaları, koloniler görünene kadar iki ila üç gün boyunca sabit veya darbeli mavi ışık altında 30 santigrat derecede inkübe edin. Ön taramayı gerçekleştirmek için, her plakadan sekiz koloni seçin ve bunları 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyularında% 2 glikoz ile desteklenmiş bir mililitre SC-HIS ortamını aşılamak için kullanın.
Hücreleri, sürekli mavi ışık aydınlatması altında dakikada 200 devirde sallanan 30 santigrat derecede gece boyunca büyütün. Ertesi gün, 600 nanometrede 0.01 ila 0.3 arasında değişen optik yoğunluk değerlerini elde etmek için her kültürü taze bir SC-HIS ortamında% 2 glikoz ile seyreltin ve kültürleri, optik yoğunluk iki ila dokuz arasında ulaşana kadar 30 santigrat derecede sabit veya darbeli ışık altında dakikada 200 devir sallama durumunda büyütün. Ardından, plakaları alüminyum folyo ile sarın, ışık panelini kapatın ve plakaları karanlıkta dakikada 200 devirle 30 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.
24 kuyucuk plakasındaki kültürleri 234 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve hücreleri% 2 glikoz ile bir mililitre taze sentetik tam bırakma ortamında yeniden askıya alın. İstenilen ürünün buharlaşmasını önlemek için steril mikroplaka sızdırmazlık bandı kullanarak plakaları kapatın. Mühürlü plakaları karanlıkta 48 saat boyunca dakikada 200 devirde 30 santigrat derecede sallayarak fermente edin.
Fermantasyonları hasat etmek için, plakaları 234 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantın 800 mikrolitresini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İlgilenilen kimyasala bağlı olarak, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, gaz kromatografisi kütle spektrometresi veya kullanılan cihaz için en uygun numune hazırlama tekniğini kullanarak başka bir analitik yöntem kullanarak analiz yapın. Her plakadan sekiz koloni seçin ve bunları 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarında% 2 glikoz ile bir mililitre SC-HIS ortamını aşılamak için kullanın.
Hücreleri karanlıkta gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün ve dakikada 200 devir sallayın. Ertesi sabah, her kültürü% 2 glikoz ila 0.1 optik yoğunluk ile taze bir SC-HIS ortamında seyreltin. Işığa maruz kalmayı önlemek için plakaları alüminyum folyoya sarın ve kültürü karanlıkta 30 santigrat derecede büyütün ve dakikada 200 devir üç optik yoğunluğa ulaşana kadar sallayın.
Daha sonra, plakaları darbeli ışık altında 30 santigrat derecede 12 saat boyunca inkübe edin ve dakikada 200 devir sallayın. Kültürleri beş dakika boyunca 234 G'de santrifüj yapın ve% 2 glikoz ile taze SC-HIS ortamında yeniden askıya alın. İstenilen ürünün buharlaşmasını önlemek için steril mikroplaka sızdırmazlık bandı kullanarak plakaları kapatın.
Kapatılmış plakaları dakikada 200 devirde 30 santigrat derecede sallayarak 48 saat boyunca ışıkta fermente edin. Optogenetik fermantasyonlar yapıldıktan sonra, kimyasal üretim iki devre ile indüksiyon sırasında bir dizi hücre yoğunluğunda test edildi. OptoINVRT7 devresi, OptoINVRT1 ve 2 devrelerine kıyasla 7.0 ve 8.75 indüksiyon değerinin optimal hücre yoğunluğuna sahip yüksek laktik asit ve izobutanol titreleri göstermiştir.
OptoAMP devrelerini kullanan fermantasyonlar, farklı hafif hizmet döngüleri tarafından tanımlanan üç aşamada incelenmiştir. Laktik asit üretimi, darbeli bir büyüme fazı ve tamamen aydınlatılmış indüksiyon ve üretim aşamaları kullanılarak optimize edilebilir. İzobutanol üretimi, darbeli bir büyüme fazı, tamamen aydınlatılmış indüksiyon fazı ve darbeli üretim fazı kullanılarak optimize edilmiştir.
Naringenin biyosentezi, darbeli bir büyüme tamamen aydınlatılmış indüksiyon ve karanlık üretim fazı kullanılarak en iyi şekilde optimize edilmiştir. OptoLAC sistemi, E.Coli'de, IPDG ile kimyasal indüksiyon kullanılarak elde edilenlerle karşılaştırılabilir veya daha yüksek olan titrelerde transkripsiyon faktörü FDER üretmek için kullanılmıştır. Mevalonat üretmek için OptoLAC devreleri uygulanmıştır ve üretim, IPDG indüksiyonu kullanılarak elde edilen titreleri aşmaktadır.
Biyoreaktör düzeyinde mevalonat üretimi, mikroplaka seviyelerinin ötesindeki bakterilerde kimyasal ve protein üretimi için optogenetik düzenlemenin ölçeklenebilirliğini ve ayarlanabilirliğini göstermektedir. Işık yoğunluğunun aydınlatılan basamaklar için uygun aralıkta olduğundan ve karanlık gerektiren basamaklarda ışık kontaminasyonunun önlendiğinden emin olmak önemlidir. Bu teknik, mayada izobutanolün rekor titrelerini elde etmenin, konsorsiyum popülasyonlarını ışıkla stabilize etmenin ve hatta sentetik ışık kontrollü organeller kullanarak metabolik akıyı kontrol etmenin yolunu açtı.
