Ribozom profilleme deneyi tarafından üretilen dizileme verilerinin yorumlanması, ribozomların mRNA üzerindeki translasyonel aktivitelerini nicel olarak ölçmek ve translasyonel düzenleme mekanizmalarını incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokolde, ribozom profil oluşturma verilerini ve genom çapında ölçekte ve tek nükleotid çözünürlüğünde mRNA translasyonunu çözmek için bir komut satırı aracı olan RiboCode'u kullanmak için hesaplama prosedürünü açıklayacağız. Bu yöntem, açıklamalı protein kodlayan genlerin dışındaki genomik bölgelerden kaynaklanan yeni peptitlerin aranmasına izin verir ve mRNA translasyon hızını ölçmek için bir fırsat sunar.
Başlamak için bir Linux terminal penceresi açın ve komutu yürüterek bir conda ortamı oluşturun. Oluşturulan ortama geçin ve komutu yürüterek RiboCode ve bağımlılıklarını yükleyin. Referans dizisinin genom referans dosyalarını almak için Ensembl web sitesine gidin, ardından indir'e ve ardından FTP indirme'ye tıklayın.
DNA FESTA sütunundaki FASTA seçeneğini tıklayın ve web sitesi sayfasındaki tabloda gösterilen türlerin insan olduğu satırı seçin. Topluluk web sitesi sayfasında, metni belirtildiği gibi bağlantıyı kopyalayın, ardından komutu yürüterek terminaldeki dosyaları indirin ve sıkıştırmasını açın. Referans ek açıklaması için, son açık web sayfasındaki sütun gen kümelerinde GTF'yi sağ tıklatın.
Bağlantıyı kopyalayın ve komutu kullanarak indirin. rRNA dizilerini almak için UCSC genom tarayıcısını açın, ardından araçlar'a tıklayın ve açılır listeden tablo tarayıcısını seçin. UCSC genom tarayıcı sayfasında, klade için memeli, genom için insan, grup için tüm tablolar, tablo için R maskesi ve bölge için genom belirtin.
Filtre için, yeni bir sayfaya gitmek üzere oluştur'u tıklatın ve rep sınıfını rRNA ile eşleştiği gibi ayarlayın. Gönder'e tıklayın ve ardından çıktı biçimini sıraya ayarlayın ve çıktı dosyası adını HG38_rRNA olarak ayarlayın. FA. Son olarak, çıktı al'a tıklayın ve ardından rRNA dizisini almak için sırayı al'ı seçin.
Sıralı okuma arşivinden ribozom profil oluşturma veri kümeleri almak için, si-eIFe tedavi grubunun çoğaltma örneklerini indirin ve komutu yürüterek bunları yeniden adlandırın. Ardından denetim grubunun çoğaltma örneklerini karşıdan yükleyin ve komutu yürüterek bunları yeniden adlandırın. rRNA kontaminasyonunu gidermek için, komutu yürüterek rRNA referans dizilerini indekslemeye başlayın.
İndekslemeden sonra, komutu yürüterek rRNA'dan kaynaklanan okumaları ekarte etmek için okumaları rRNA başvurusuna hizalayın. Komutu yürüterek bir genom indeksi oluşturarak başlayın. Ardından, komutu yürüterek rRNA kontaminasyonu olmadan temiz okumaları oluşturulan referansla hizalayın ve ardından komutu yürüterek hizalama dosyalarını sıralayın ve dizine ekleyin.
Komutu yürüterek transkript ek açıklamalarını hazırlayın. Belirli uzunluklardaki ribozom korumalı parçaları seçin ve komutu yürüterek P sitesi konumlarını tanımlayın. Her örnek için yapılandırma dosyalarını düzenleyin ve birleştirin.
Ardından komutu yürüterek RiboCode'u çalıştırın. Okumaların uzunluklarının frekans dağılımı, çoğu ribozom korumalı parçanın 25 ila 35 nükleotite karşılık geldiğini göstermiştir. Ribozom korumalı parçaların farklı uzunlukları için P-site konumları, beş ana uçlarından açıklamalı başlangıç ve bitiş kodonlarına olan mesafeler incelenerek belirlendi.
Haritalama sonuçları, 10.394 genin açıklamalı açık okuma çerçevelerini kodladığını göstermektedir. Ayrıca, 509 ve 168 gen, yukarı akış ve aşağı akış açık okuma çerçevelerini kodlarken, 939 gen, bilinen açıklamalı açık okuma çerçeveleriyle örtüşen yukarı akış veya aşağı akış açık okuma çerçevelerini kodlar. Ayrıca, 68 protein kodlayan gen ve 2.601 kodlamayan gen, yeni açık okuma çerçeveleri için kodlar.
Uzunluk dağılımı, yukarı akış, aşağı akış, yeni ve üst üste binen açık okuma çerçevelerinin açıklamalı açık okuma çerçevelerinden daha kısa olduğunu gösterdi. Her açık okuma çerçevesi için göreceli ribozom korumalı parça sayıları hesaplandı ve yukarı akış açık okuma çerçevelerinin ribozom yoğunluklarının eIF3e eksik hücrelerinde kontrol hücrelerinden önemli ölçüde daha yüksek olduğu ortaya çıktı. Metagen analizi, başlangıç kodonunun aşağı yönündeki 25 ve 75 numaralı kodonlar arasında bir ribozom kütlesinin durduğunu ortaya koydu ve bu da translasyon uzamasının eIF3e eksik hücrelerinde erken bloke edilebileceğini düşündürdü.
PSMA6'nın yukarı akış açık okuma çerçeveleri ve SENP3-EIF4A1 geninin aşağı akış açık okuma çerçeveleri için P-siteleri yoğunluk profilleri incelendi ve ribozom korumalı parçaların periyodiklik kalıpları ve yoğunlukları gösterildi. Bilinen protein kodlama bölgelerinin başlangıç ve bitiş kodonları etrafındaki okumaların konumlarını kontrol etmek, her uzunluk için okumaların periyodik özelliklerini değerlendirmek için gereklidir. RiboCode, başka bir komut satırı aracıyla birlikte, RiboMiner ayrıca kalite kontrolü ve ribozomların öngörülen açık okuma çerçevelerindeki doluluklarını ölçmek ve görselleştirmek gibi çoklu analizler gerçekleştirebilir.
Bu hesaplama aracı, belirli fizyolojik bağlamlarda ribozom profil oluşturma verileriyle kanonik olmayan çeviri olaylarını ve çevirinin uyarana yanıt olarak nasıl modüle edildiğini tanımlamak için yüksek verimli bir yol sağlar.
