Bu çalışma Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (BMBF), (Sistem Biyolojisi Helmholtz Alliance) Kanser sinyal ve sistemler Biyoloji ve Alman Kanser Araştırma Merkezi (DKFZ) tarafından desteklenmiştir.

Bütün hayvan deneyleri DKFZ kurumsal kurallarına uygun olarak yapıldı. Dikkat: numune RNAse kirlenmesini önlemek RNAse kirlenmesini önlemek için temel önlemleri almak ve DEPC ile muamele edilmiş su ile tüm tamponlar hazırlamak için. Sakkaroz Gradyanların 1. Hazırlanması <ol><li> (Bkz. Tablo 1) 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 ve% 50 sakaroz çözümler hazırlayın. Yavaş yavaş polyallomer ultrasantrifüj tüpün dibine% 50 sukroz çözeltisi 2 ml eklenerek gradyanları hazırlanması başlayın. -80 ° C&#39;de 20 dakika boyunca tüpler yerleştirerek tabaka Freeze </li><li> 17.5% sakaroz kadar biten, aralarında donma adımlarla sakaroz yüzdeleri azalan de sonraki katmanlar ekleyebilirsiniz. Temel tabakaların çözülme önlemek amacıyla sukroz solüsyonunun ilave edilmesi sırasında buz üzerinde gradyanlar tutun. </li><li> Taze bir gün kullanımdan önce sakaroz yoğunluğu hazırlayın ve 4 ° C&#39;de tutmak Alternatively, deneyden önce gece 4 ° C&#39;de -80 ° C ve çözülme, önceden mağaza gradyanlar hazırlar. </li></ol> 2.. Doku Hazırlama (Omurilik ve / veya Beyin) <ol><li> NaCl xylazin ve ketamin bir doz aşımı fare anestezisi ve transcardially ilişkili transkript üzerinde ribozomlar durağanlaştırır 200 ug / ml cHx içeren Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 20 ml ile serpmek. Ayak tutam yanıt alınamayan tarafından uygun anesthetization onaylayın. </li><li> Hızlı doku ekstrakte edin. Kafatası Dorsalinden açın ve beyin ayıklayın. Tüm Torakal ve lomber vertebral kolonun laminektomi gerçekleştirin ve omurilik ayıklayın. Sırasıyla, bütün beyin (~ 400 mg) ya da spinal kord (~ 90 mg) ihtiva eden bir 4 cm bir parçası, kullanın. </li><li> Soğuk homojenizasyon tampon A içine doku aktarın (bkz. Tablo 1) (1 mi; beyin: omurilik 4 mi) ve sikloheksimid artan nüfuz etmesine imkan verir için temiz bir neşter ile, küçük parçalar halinde zar. Perform buz üzerinde tüm ileri adımlar. </li><li> 15 dakika boyunca inkübe edin ve mekanik bir Dounce homojenleştirici kullanılarak doku homojen hale getirilir. Dikkatle kontrol homojenizasyon çekirdekler bozulmadan kalmasını sağlamak için gereklidir. Tüm numuneler karşılaştırılabilirliği sağlamak için tam olarak aynı şekilde davranın. Not: beyin dokusu için: sıkı bir şekilde uyan havan tokmağı ile 5 vuruş dokuyu bozacak. Omurilik dokusu için: sıkı bir şekilde uyan havan tokmağı ile 5 daha fazla vuruş ardından gevşek montaj havan tokmağı ile 5 vuruş ile bozabilir. </li><li> Alikotları (beyin ve omurilik için 200 ul için 400 ul), total RNA izolasyonu için -80 ° C de hızlı dondurulması ve depolanması al. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj ile hücreler ve undisrupted hücre ve doku parçaları kaldırma Düşük hız santrifüj ribozomların kaybını önler. </li><li> NP-40 eklenmesi ve deterjanlar sodyum deoksikolat (% 1 &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar her biri) ile 30 dakika boyunca çekirdekler serbest süpernatan içinde Lyse membran fragmanları. </li></ol><ol><li> Bu adım, aksi polyribosome profilindeki sinyal maskeler numuneden yağ bileşenleri kaldırır. İlk olarak, önceden soğuk ultrasantrifüj kova ve 4 ° C&#39;de rotor ve 2 M, 1.1 M ve 0.9 M hazırlamak sakaroz çözeltileri (Tablo 1 e bakınız). </li><li> 2 M sukroz çözeltisi bir 1.22 hacmi ile karıştırın ve lisat, bir polietilen bir ultra santrifüj tüpüne aktarılır. 1.1 M sukroz çözeltisi ile 10 ml eşit hacimde tüm tüpler doldur, daha sonra 0.9 M sukroz çözeltisi ile dikkatli bir şekilde kaplar. </li><li> Önceden soğutulmuş ultrasantrifüjdeki kova içine ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin. 4 ° C&#39;de 100,000 x g&#39;de, 3 saat boyunca santrifüj Katı yağ bileşenleri yüzer ve yüzer kalır ise, bu işlem sırasında topak içinde toplanmasına ribozom. </li></ol> 4.. Sükroz Gradyan Bölünmesi <ol><li> Süpernatantı ve homojenizasyon tamponu B pelet çözülür (bkz. Tablo 1 </stRong&gt;). NanoDrop veya eşdeğer cihazı kullanılarak her numune için 260 nm&#39;de absorbansı ölçülür ve absorbans değerine göre normalize yük miktarları. </li><li> Önceden soğutulmuş ultrasantrifüj kova (preparasyon, bir önceki bölümde tarif edilmiştir) sakaroz gradyanları yerleştirin. , Gradyanın üzerine tabaka dikkatle örnekleri. Teknik kontrol olarak boş bir sukroz gradient ekleyin. </li><li> Homojenizasyon tampon maddesi ile her bir bölüm ağırlığını ayarlayın. 4 ° C&#39;de 285,000 x g&#39;de santrifüjleyin 1.5 saat için örnekler </li><li> Santrifüj bitmeden Isco parçalama 30 dk hazırlanıyor başlayabilirsiniz. Fraksiyonatör başka bir model kullanılırsa, üreticinin protokolünü uygulayın. <ol><li> UV lamba için uygun ışık hassasiyeti (beyin veya omurilik için 0.05 AUFS için 0.2 AUFS) ayarlayın ve ısınma için açın. Bu tüp aracılığıyla delici% 60 sukroz çözeltisine haddeleme pompa yoluyla bağlamak, tüp delici birleştirin. </li><li> Sakaroz (akış sıçan pompalayarak kurulumu testE: 1 ml / dak), özellikle degrade içine kabarcıklar tanıtacak borulama hiçbir sızıntı olmadığından emin olun. </li><li> Elle UV dedektör içine degrade tampon pompalama ve temel düzelterek Blank arka emilim. </li></ol></li><li> Dikkatli bir rotordan tortulaşmış örnekleri ile sükroz gradyanları içeren ultrasantrifüj kova çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Çözünürlük kaybını önlemek için geçişlerini herhangi darbeleme kaçının. </li><li> Kincinin çalıştırın geçişlerini. İlk plan emilimini değerlendirmek ve uygun teknik kurulum sağlamak için boş geçişlerini çalıştırın. <ol><li> UV dedektörüne gradyanı takın ve boru delici ile tüpün alt kısmını delmek. Yukarı UV dedektörüne ve açılan dağıtıcı içine çöktürülmüştür örnekleri ile gradyan ettirilir% 60 sükroz pompalama başlatın. </li><li> 260 nm&#39;de absorbans sedimenta gösteren zirveleri ile, numune için emme profili oluşturmak belgelenmiştirribozomal alt birimlere, monosomes ve ribozomların daha sonra artan sayı ile ilişkili mRNA tion. </li></ol></li><li> (2 ml tüpler içinde 600 ul, her biri) damla dağıtıcı yoluyla 20 fraksiyonlar halinde numune toplayın. </li></ol> Bireysel Kesirler 5. RNA İzolasyon <ol><li> Bireysel fraksiyonlar için% 1 &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar% 10 SDS ilave edin ve proteinler açılmak ve ribozomların ayırmak için iyice karıştırın. Bu noktada numune -80 ° C de dondurulabilir Ele alınması için bir soru ile ilgili olarak, parçacıklar absorbans profiline uygun olarak toplanmış olabilir. </li><li> Ayrıca, DNA kirletici izlerini ortadan kaldırır asidik fenol / kloroform ekstraksiyonu ile RNA izole edilir. <ol><li> Her bir örnek için (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) asidik fenol / kloroform, bir hacim ekleme, 10 ° C&#39;de 65 dakika ve daha sonra davlumbaz altında serbest bırakma basıncı, ısı. </li><li> Oda sıcaklığında 17,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj örnekleri. Dikkatli bir şekilde yeni bir 1.5 ml sulu faz transferitüp. Sulu faz santrifüj sonra altta olabilir yoğun sakaroz kesirler, faz inversiyon farkında olun. </li><li> RNA&#39;yı çöktürmek için bir izopropanol hacmi, 1/9 hacim sodyum asetat (pH 5.2), ve her bir örnek için 1 ul Glycoblue ekleyin. -80 ° C &#39;de numuneler, en az 1 saat devam </li><li> 17,000 x g ve 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca santrifüj Glycoblue pelet görüntülenmesini sağlar. Süpernatantı, buz% 80 etanol ve hava kuru pelet ile bir kez pelet yıkayın. RNAse içermeyen su içinde pelet çözülür. </li></ol></li><li> Nanodrop tarafından RNA miktarını ölçmek ve bir Bioanalyzer çip RNA bütünlüğünü analiz. Sunulan protokol ile elde edilir RNA mikrodizi ve derin sekanslama dahil olmak üzere sanat yüksek verimli tahlillerin her durum için uygundur. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.

Polyribosome fraksiyonasyon yeni bir teknik değildir, ancak, bu, özellikle zor bir kalır. Giriş maddesinin göre, önemli optimizasyonu gerekli olabilir. Bu, özellikle maddenin miktarı genellikle doku bileşenlerinin çeviri mRNA&#39;ların izole engelleyen bir sınırlama ve yağlı olan in vivo CNS örnekleri, için de geçerlidir. En yayınlanan fraksiyon protokolleri maya veya memeli hücre hatları ile anlaşma ve beyin 12,13,14 için kurulan protokolleri vardır. Bunun aksine, omurilik fraksiyonasyon açıklayan yayınlar herhangi bir zorlukla vardır ve önceki protokol 15, toplanmış edilecek hayvan çok sayıda omurilik gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, birkaç temel modifikasyonlar tek bir fare omurilik dahil CNS dokular için fraksinasyon protokol uyum için yapılmıştır. Siklohekzimidsiz ile Ribozom immobilizasyon Durin ribozomların ayrılmasını önlemek için hayvan perfüzyon sırasında yapılırdoku çıkarma g uzun bir süreç. Daha sonra, RNA polysomal polyribosome verimini en üst düzeye çıkarmak için özel bir şekilde ekstre edilmiştir. İlk olarak, douncing ile doku homojenizasyon kontrol sağlam çekirdeği tutar ve DNA kirlenmesini önler. Çekirdeği, daha sonra santrifüjleme ile güvenilir bir şekilde uzaklaştırılır. NP-40 deterjan ve sodyum deoksikolat kombinasyonu, endoplazmik retikulum ve membran bağlantılı ribozom salım lizizine sağlar. Buna ek olarak, lipid açısından zengin olan miyelin UV emici bileşenler polyribosome profilleri gizleyebilir. Böyle poliribozomların gibi yoğun bileşikler topaklandı ve miyelin şamandıra gibi hafif bileşikler ve 16 kaldırılır nerede miyelin yüzdürme, bu nedenle gereklidir. Poliribozomların daha sonra 17.5% to 50% sukroz gradyanı üzerine çöktürülür. Yerine elle her sakaroz katman katman ve dondurma, geçişlerini de bir degrade mikser kullanarak hazırlanabilir. Asidik fenol / kloroform kullanılarak fraksiyonlardan RNA ekstraksiyonu sağlar: DNA az RNA kaybı ile kaldırılacak. Bununla birlikte, faz ters çevirme (fraksiyon 16 yukarıda) yoğun sükroz kısımların oluşabilir. Bu protokol, çeviri düzeyini ele diğer geleneksel yöntemler üzerinde avantaj sağlamaktadır. Örneğin, fosforile S6 (önemli bir çeviri işaretleyici) ölçümü yanı sıra radyoizotop ile doğmakta zincirleri etiketleme hem küresel çeviri düzeyleri hakkında bilgi verir ama özellikle tercüme ediliyor ne az ortaya koymaktadır. Polyribosome fraksiyonasyon, diğer taraftan, değerlendirme küresel çeviri değil, aynı zamanda çeviri mRNA ve ilgili düzenleyici proteinlerin kimlik sağlar. Kantitatif gerçek zamanlı PCR seçilen mRNA&#39;lanmn dışarı hızlı okuma için izole RNA&#39;lar yapılabilir ve mikroarray&#39;ler ve sonraki nesil dizileme RNA genom çalışmaları için yapılabilir. Burada sunulan, bu nedenle en iyi duruma azaltılması, bu teknik CNS dokuların minimal miktarda kullanılmasına izingerekli hayvan sayısını ing ve doku işlem süresini azaltarak genel deneysel kalitesinin artırılması. Öte yandan, bu teknik, çeviri olanlardan takılmış iken ribozomlar ayırt edemez. Durdu ribozomlar taşıyan transkript ağır kesirler çöktürmek edecek ve verileri yorumlayarak bu akılda tutulmalıdır. Ribozom, bir hücre tipi özel bir şekilde, sırasıyla epitop etiketleri veya muhabir ile etiketlenmiş ve immüno-çökeltme ile izole edilmiş mRNA 17,18 ilişkili olan, son bildirilen teknikler, yani RiboTaq ve TRAP vardır. Bu teknik, özel hücre popülasyonları için okuma yüksek çözünürlük sunan fraksiyonasyon polyribosome akuple edilebilir. Ribozom ayak baskı ribozomlar tarafından korunmaktadır mRNA&#39;lar başka bir yeni küçük fragmanları üretmek için nükleaz sindirimini içerir tekniği ya da &quot;ayak izi&quot; dir. Kütüphane daha sonra bu ayak oluşturulur ve dizilenmektedir. Bu yöntem, ataçeviri üzerine bir kodon-özel tüm genom analizi IDE ve durdu ribozomlar tespit etmek mümkün değildir, olmayan-Ağustos kodonları ve polyribosome fraksiyonasyonu 19 tarafından elde edilemeyen küçük memba açık okuma çerçeveleri, başlatın. Ancak, fraksiyonasyon polyribosome, böylece yüksek saflıkta örnek genellikle gerekli olduğu bir kütüphane hazırlanması için gerekli olan moleküler türler için zenginleştirici, bir ribozom içeren sindirilmiş fragmanlarının izole edilmesi için bir ribozom profil akuple edilebilir. Birlikte ele alındığında, polyribosome ayırma kalıcı öneme sahip esnek bir metot olup, yeni nesil genom sekanslama gibi deneyler dahil olmak üzere çeşitli alt uygulamalara akuple edilebilir.

Gen ekspresyonu için, en büyük bir etki 1 açısı ile, transkripsiyon, çeviri ve mRNA ve proteinlerin stabilitesi birleşik etkisi ile belirlenir. Bu adımların her biri son derece düzenlenmiş olduğunu şimdi açıktır. Mikro-RNA&#39;lar, RNA granül, alternatif ve sitoplazmik poliadenilasyonun oluşumu gen ifadesinin 2,3 post-transkripsiyonel düzenlenmesinde bazı örnekleridir. Bu mekanizmaların her biri çevirisinden transkripsiyon birbirinden ayrılacak ve ilgi duyulan biyolojik sistemde proteomesini etkilemektedir. Böylece, şaşırtıcı olmayan bir şekilde, yalnız mRNA düzeyleri protein düzeylerinin 4 kusurlu bir okuma vardır. Kantitatif proteomiks Ancak son gelişmelere rağmen, hassasiyet ve protein dizi çözünürlükte önemli sınırlamalar hala var, gen ifadesinin en doğrudan değerlendirmesini sağlar. Bu nedenle translatome adresleme, çeviri mRNAların repertuarı, eğitim arasında mükemmel bir denge sunuyortranscriptome ve proteomdaki. Bu nihai gen ifadesini değerlendirirken transkriptomik daha doğru ve daha yüksek kapsama alanı ve daha proteomikte dizisi çözünürlük hem de sağlar. Memeli sistemlerde, çeviri olayların çoğu kapak bağımlı başlaması ile başlar. Birlikte 40S ribozomal küçük alt-birimi ile ökaryotik başlatma faktörleri bir grup bir mRNA&#39;nın 5 &#39;başlık ile birleşir. Kompleks, daha sonra mRNA tarar ve Ağustos başlangıç ​​kodonu ulaştıktan sonra, tam bir 80S ribozom oluşturulması için 60S ribozomal alt birimini büyük işe. Uzama aşama ribozom uzama faktörleri, olgunlaşmamış peptid zincirine tRNA&#39;ların yüklü amino asitlerin dahil edilmesi yardımcı ile, mRNA&#39;nın boyunca hareket ile devam eder. Çoklu eş zamanlı olarak tek bir ribozomlar mRNA boyunca devam edebilir ve ilişkili ribozom sayısının protein sentezi 5,6 oranı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu ribozomal yükleme tran için güvenilir bir gösterge yaparslation ve aktif sedimantasyon dayalı mRNA&#39;ları çeviri ayrılmasını sağlar. MRNA çeviri miktarının ilave olarak, sekans bilgileri için düzenlenmesinde rol oynayan motifleri tanımlamak için elde edilebilir. Ayrıca, bağlayıcı proteinler ve diğer faktörler için ilgili düzenleyici proteinlerin çalışma ve keşif kolaylaştıran farklı fraksiyonlarından izole edilebilir RNA. Sinir sisteminde, translasyon kontrol mRNA depolama, taşıma ve yerel protein sentezi gibi işlemler ile bağlantılı olmuştur. Büyüme konileri akson 7 geri kalanından farklı mRNA belirli bir lokalize havuz liman gösterilmiştir. Buna ek olarak, lokal akson proteinlerin 8,9 sentezleme yeteneğine sahiptirler. Sonuç olarak, çeviri lokal kontrol nörobiyoloji çalışmanın önemli bir konu haline gelmiştir. Bu adrese polyribosome fraksiyonasyon potansiyel tekniği için kullanılan edildiği, çeşitli çalışmalarda gösterilmişomurilik gelişiminde akson rehberlik araştırmak ve beyin 10,11 BDNF aktivite bağımlı çeviri gösterdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Çoklu işlemleri mRNA ve proteinlerin transkripsiyon, çeviri ve stabilitesi de dahil olmak üzere gen ekspresyonu katılmaktadırlar. Bu adımların her biri sıkıca protein bolluğu nihai dinamiklerini etkileyen düzenlenir. Çeşitli düzenleyici mekanizmalar, tek başına gen ifadesinin güvenilir bir göstergesi mRNA seviyeleri veren, translasyon adımında bulunmaktadır. Buna ek olarak, mRNA çevirisinin düzenlenmesi yerel özellikle nörobiyolojisinde ilgi odağı &#39;translatomics&#39; kayması, nöronal işlevleri implike edilmiştir. Sunulan bir yöntem köprü transkriptomik ve proteomics kullanılabilir. Burada birden çok ribozomlara aktif tercüme mRNA&#39;ların birlikte ve sukroz meyilleri içerisinde ayırıcı sedimantasyon göre translatome sorgular polyribosome paylarına ayırma tekniği için gerekli değişiklikleri açıklar. Geleneksel olarak, özellikle merkezindeki in vivo örnekleri, çalışmal sinir sistemi (CNS) nedeniyle malzemenin sınırlı miktarda ve yağ dokusu bileşenlerinin varlığı zor olduğu kanıtlanmıştır. Tek bir fare omurilik ve beyin kullanımı ile gösterildiği gibi, bu sorunu çözmek amacıyla, tarif edilen protokol, özellikle merkezi sinir sistemi materyalin minimum miktarda ile kullanım için optimize edilmiştir. Kısaca, CNS doku özü çıkarıldı ve çeviri ribozom sikloheksimid ile mRNA üzerinde immobilize edilir. Miyelin yüzdürme sonra lipid zengin bileşenleri kaldırmak için yapılır. Fraksiyonlama mRNA ribozomal kendi yüküne göre ayrılmış bir sükroz gradyanı üzerinde gerçekleştirilir. İzole edilmiş parçalar, yeni genom genişliğinde deney teknolojiler de dahil olmak üzere alt deneylerde, bir dizi için uygundur.

Şekil 2, kısımlara ayırma sonrası Örnek polyribosome profillerini göstermektedir. Hücre çizgileri için daha önce tarif edildiği gibi, beyin ve omurilik profilleri karakteristik emme eğrilerini gösterir. küçük ribozomal alt birimlere (40S) hafif fraksiyonlar sediman ve bağlı mRNAları büyük ribozomal alt birimi (60S) ve monosome (80S) bağlı mRNAları ardından profilinde bir zirve, ilk olarak görünür. Birden ribozomlara bağlanır mRNAları sonra zirveleri bağlı ribozomlar artan sayıda belirtilerek, ağır fraksiyonlar çöktürmek. Küresel çeviri profilinden değerlendirilebilir. Bir örnek olarak, beyin dokusu daha aktif Çeviri gösteren, omurilik dokusu daha oranını monosome için daha yüksek bir polyribosome sahiptir. Bireysel fraksiyonlardan ekstre 18S RNA ve 28S rRNA dağılımını gösteren, Bioanalyzer ile değerlendirildi. 18S rRNA küçük ribozomal alt birimi hafif sucr in çöktürülmesi, uygun olarak, profil daha önce görünür<html> ose kesirler. Toplam RNA&#39;nın tipik verimler, beyin ve omurilik için 2-4 mikrogram için 10-20 ug bulunmaktadır. Bireysel kısımlarındaki RNA verimleri fraksiyonu bağlı olarak, sırasıyla 4 ug ve beyin ve omurilik için 0.8 ug kadar vardır. Boş bir sukroz gradyanı nedeniyle zaten DTT varlığına bağlı olarak, 260 nm &#39;de bir arka plan emme gösterir. Bu arka plan örnek değerlerini normalleştirmek için veri analizi sırasında çıkartılabilir. EDTA tedavi sedimantasyon profil çeviri nedeniyle göstererek, polyribosome doruklarına çöktü. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Akışı ve in vivo polyribosome fraksiyonasyon potansiyel uygulamaları.&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Boş degrade ve beyin olmadan Şekil 2.. (A) beyin ve Bioanalyzer tarafından çıkarılan RNA değerlendirilmesi ile omurilik, tipik polyribosome profilleri. (B) Mah-PCR ile kesirler üzerinde gapdh mRNA Dağılımı. (C) Polyribosome profilleri EDTA tedavisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2x degrade tampon </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7.4, 30 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 200 ug / ml siklohegzimid (CHX), 2mM ditiyotreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisini% 17,5 </td><td> 8.67 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisini% 25.6 </td><td> 12.8 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisini% 33.8 </td><td> 16.9 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisini% 41,9 </td><td> 20.95 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisi% 50 </td><td> 25 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homojenizasyontampon A </td><td> 0.25 M sukroz, 50 mM Tris / HCl, pH 7.4), 5 mM MgCI2, 25 mM KCI </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M sakaroz çözüm </td><td> % 68.4 sakaroz, 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 5 mM MgCI2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M sukroz solüsyonunun </td><td> % 38.5 sakaroz, 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 5 mM MgCI2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M sukroz solüsyonunun </td><td> % 30.8 sakaroz, 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 5 mM MgCI2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampon B </td><td> 0.25 M sukroz, 50 mM Tris / HCl, pH 7.4, 5 mM MgCI2, 25 mM KCI,% 1 NP-40,% 1 sodyum deoksikolat </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tamponlar ve çözümleri Tablo 1.. Listesi.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K Görüntüleme.  German Cancer Research Center (DKFZ).  Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar. 

Video: In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optik Sinir transeksiyonu: Santral Sinir Sistemi Yetişkin Nöron Apoptoz Bir Model

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Nörobilim

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Kök ve Ağ Kültürlerde Biyolojik nörotoksinlerin Fonksiyonel Değerlendirme Merkezi Sinir Sistemi Nöronlar Hücre-türetilmiş

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...