Bu araştırma aynı zamanda CIHR Genç Araştırmacı Ödülü bir alıcı BT Sağlık Araştırma hibe Kanada Enstitüleri (CIHR MOP-115195) ve FRQ-S, tarafından desteklenen; ve İsveç Araştırma Konseyi ve İsveç Kanser Derneği OL

1.. Sükroz Gradyan hazırlanması <ol><li> % 60, 100 ml GKD 2 O. (w / v) sakaroz çözeltisi hazırlayın Çözüm fraksiyonasyon aşama (aşama 3,5) sırasında boru tıkanmasını önlemek için 0.22 um&#39;lik bir filtreden filtre edilmelidir. </li><li> 200 mM HEPES (pH 7.6), 1 M KCI, 50 mM MgCI2, 100 ug / ml sikloheksimidin, 1x proteaz inhibitör kokteyli (EDTA-serbest), 100 birim / ml RNase inhibitör: 10x sukroz gradyanlı tampon 5 ml hazırlayın. </li><li> Adım 1.1 &#39;de tarif edildiği gibi hazırlanan% 60 çözeltisi kullanılarak, 40% 5 ml ve 1 x sukroz gradyanlı tamponu içinde% 50 sükroz cevap verir. </li><li> (Toplam 6 ultrasantrifügasyon tüpler) katman için her polyallomer ultrasantrifügasyon tüp üzerinde yarım-tam noktasını işaretlemek için degrade makinesi ile sağlanan Marker bloğunu kullanın. Bu yarım-tam noktaya ulaşıncaya kadar degrade makinesi ile sağlanan katman cihazı kullanılarak,% 5 sakkaroz çözüm ekleyin. Daha sonra, Engellere kadar altından% 50 sukroz çözeltisi eklemeiki çözelti arasındaki ace yarı-tam noktaya ulaşır. Bu (aşağıya bakınız), yüksek tekrarlanabilirliği elde etmek için gerekli olduğu gibi bileşenler, mümkün olduğu kadar benzer, böylece özel bir dikkat Bu aşama sırasında alınmalıdır. </li><li> Degrade makinesi ile sağlanan oranı zonlu kapakları tüpleri Mühür ve degrade makinesi üzerinde tüp tutucuya mühürlü tüpler aktarın. </li><li> Doğrusal bir% 5% 50 degrade elde etmek degrade makinesi çalıştırın. 6 doğrusal geçişlerini yüksek eğim açısında dönme tarafından birkaç dakika içinde oluşturulacaktır. Not: Sakaroz gradyanlar 6 ay için derhal kullanılır yada -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2.. İzolasyon ve polizom Sedimantasyon <ol><li> Hücre tipine bağlı olarak, 1-5 15-cm Petri kutularına (~ 15 x 10 6 hücre) liziz önce en az bir gün, hücrelerin tohum. Deneylerin günde hücreler,% 80 konfluent olmalıdır. <!-- Not: çeviri ve çoğalma hızları doğrudan çünkü Optimal konfluensisinin kritik8 orantılı ve bu nedenle polisomlann aktif çoğalan hücrelerinde analiz edilmelidir (hücrelerin düşük konfluensisinin daha fazla analiz için yeterli malzeme sağlar olmayabilir oysa yani kurları önemli ölçüde birleşen hücreleri üzerinde düşecektir). Örneğin deneyci çeviri üzerinde temas inhibisyonu etkisi okuyan ilgilenen varsa, bu kuralın istisnaları yapılabilir. Bununla birlikte, bu hücreler, translatome üzerinde istenmeyen etkilere sahip olabilir, çok uzun süre boyunca konfluent koşullarda altında tutulması gerekir. Transfeksiyon gerekli ise, ticari olarak temin edilebilir kitlerin çoğunun Polizom seviyelerini etkilemez. Transfeksiyon hücrelerin günde% 80-90 ortak akışlı olması gerekir, çünkü bu ~% 80 konfluent hücreler 24 saat post-transfeksiyon yaymak ve hücreleri polizom 48 saat post-transfeksiyon izole edilmesi tavsiye edilir. </li><li> 5 37 ° C&#39;de ve 5 dakika için büyüme ortamı içinde 100 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda sikloheksimid hücreleri inkübeCO% 2; ve 100 ug / ml sikloheksimidin içeren buz gibi soğuk 1 x 10 ml PBS ile iki kez yıkama hücreleri. Sikloheksimid böylece ribozom çalıştırmak 20 kapalı önlenmesi, mRNA üzerinde ribozomlar &quot;donuyor&quot; bir çeviri uzama inhibitörüdür. </li><li> 100 ug / ml sikloheksimidin içeren buz gibi soğuk 1 x PBS, 5 ml, yavaşça hücreler kazıma ve 50 ml&#39;lik bir tüp içinde toplamak. Bu adım, oldukça hızlı zaman uzun bir süre için buz üzerinde hücreleri terk ederken büyük ölçüde polisom hazırlık kalitesini düşürecek yapılır önemlidir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplayın </li><li> Hipotonik tampon maddesi içinde 425 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri imha [(5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2.5 mM MgCl2, 1.5 mM KCI ve 1x proteaz inhibitör kokteyli (EDTA-içermeyen)], 10 mg 5 ul ekle / CHX mi, 1 M DTT, 1 ul,% 10 Trito 25 ul ilave edildi ve ardından 5 saniye boyunca RNAse inhibitör ve vorteks 100 unitsn X-100 (nihai konsantrasyon% 0.5) ve% 10 sodyum deoksikolat 25 ul (nihai konsantrasyon% 0.5) ve 5 saniye boyunca girdap. Hafif bir deterjan koşullar nükleer zarfı bozmadan sitosolik ve endoplazmik retikulum ilişkili ribozomlar çözündürülmesi için kullanılır ise nedeniyle hücre şişmesi, hipotonik tampon maddesi, plazma membranı bozacak. </li><li> 7, 4 ° C&#39;de dakikada ve yeni önceden soğutulmuş 1,5 ml tüp transfer yüzer (~ 500 | il) için 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin lizatları. Bir spektrofotometre kullanılarak, her numune için 260 nm&#39;de OD&#39;yi ölçün ve sitosolik sabit durum mRNA düzeylerini belirlemek için kullanılacak girdi olarak lizat% 10 tutun. , RNAse serbest H2O içinde 750 ul için giriş seyreltin Trizol 750 ul ve sıvı azot içinde hızlı dondurma ekleyin. </li><li> Önceden soğutulmuş rotor kova sakaroz geçişlerini içeren ultrasantrifüjdeki tüpleri aktarın. Sakaroz gradyanları üstünden 500 ul çıkarın. Aynı OD (10-2 içerir, böylece lizatları ayarlayınLiziz tamponu içinde 500 ul, 260 nm&#39;de OD 0) (adım 2.5 de tarif edilmiştir) ve her bir sükroz gradyanı üzerine yerleştirin. Not: Bu eleştirel Polizom hazırlıkları kalitesini artıracak gibi, hemen Yokuşta lizatlarını yüklemek önemlidir. </li><li> Tartılır ve ultra-santrifüj önce her bir derece dengesi. </li><li> SW41Ti bir rotor kullanılarak 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca 222,228 x g&#39;de (36.000 rpm) santrifüjleyin. Not: sakaroz geçişlerini bozacak etmemek için, &quot;düşük&quot; fren seçeneği seçili olmalıdır. </li></ol> 3.. Polizom Fraksiyonu ve RNA Ekstraksiyon <ol><li> RNaz ZAP (birkaç spreyler) içeren ılık RNAse ücretsiz su ile temizleyerek kısım toplayıcısı hazırlayın. Sadece sıcak RNAse ücretsiz su ile bu adımı tekrarlayın. UV lamba anahtarı ve yeşil ışık görünmesi için bekleyiniz. </li><li> Dikkatle rotor tüpleri çıkarın ve buz koyun. Bilgisayar, pompa, UV dedektör ve fraksiyon toplayıcı açın. 3 ml / dk ve fil Seti pompal bu iğne ulaşana kadar peşinde solüsyonu [% 60 (ağ / hac)% 0.02 sukroz (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi] ile boru. Emin, en azından bir damla iğne çıkan görmek için yapmak ve hiçbir kabarcıklar pompa şırınga veya boru tanıtıldı olduğunu tespit. </li><li> Bir fraksiyon kolektörü içinde 2 ml tüpler yerleştirin. Analiz programı başlatın ve + / duyarlılık set - 10 MeV. 100 sn &quot;tabanını&quot; olarak ayarlayın. </li><li> Tüp dik konumda olduğundan emin yaparken UV dedektör içine her ultrasantrifujleme tüp yerleştirin. Tüp tutucu altındaki düğmeyi çevirerek iğne ile tüp delmek. </li><li> 1.5 ml / dk &#39;da pompayı ayarlamak ve (bu, her fraksiyonda ~ 750 ul neden olur) fraksiyon toplayıcı 30 saniye için zaman ayarı fraksiyonları toplayın. &quot;Uzak konumunda&quot; pompa koymak, pompa ve fraksiyon toplayıcı başlatın ve aynı zamanda DAQ izleyici kullanarak kaydetmeye başlayabilirsiniz. Bu sakaroz gra bir yukarı doğru yer değiştirmesini başlayacakdient ve 254 nm&#39;deki UV absorbansı bir anda algılama. Kısa sürede kovalayan çözümün ilk damla olarak tüp toplama bir 2 ml düşüyor toplama durdurun. </li><li> . Csv formatında izleme kaydedin ve UV absorbans profilindeki her fraksiyonun konumlandırma belirlemek için aşağıdakileri yapın, bir elektronik tablo uygulamasında, (bir kez 3.7 tamamlanır adım): <ol><li> 254 nM &#39;de karşılık gelen değerler içeren sütunu seçin (kanal 0). </li><li> Absorbansların düzgün bir çizgi dağılım grafiği oluşturun. </li><li> Her bir fraksiyonun bir kısmı (30 saniye) toplama süresi olarak 5% 50% sukroz gradyanı (~ 12 mi) hacmini bölünmesi ile elde edilen 300 (değerine X ekseninin büyük ayarlanmalıdır. </li></ol></li><li> Her fraksiyonda Trizol 750 ul ilave edin ve sıvı nitrojen içinde fraksiyonlar dondurma. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak Trizol protokol kullanılarak Polizomdan ilişkili ve (2.6) sitosolik RNA izole edilir. RNA verimi artırmak için, RNA Preci devam30 dakika, -20 ° C, gece boyunca -80 ° C&#39;de pitation. Not: polysomal fraksiyonları çöktürülmüş RNA miktarı açıkça görünür olmayabilir Çünkü taşıyıcı eklemek için tavsiye edilir. Trizol protokolü esnasında RNA çökeltme aşamasından önce taşıyıcı tüpe 1 ul ekle. </li><li> Fraksiyonları (yaklaşım 3.6 kullanılarak tarif)&gt; 3 ribozom ile ilgili mRNA karşılık belirlemek ve bu kesirler havuzu. (2.6) toplanmış Polizomdan ilişkili ve sitozolik RNA temizleme gerçekleştirmek için RNA temizleme kiti kullanın. Mikrodizinleri veya derin-sıralama kullanarak genom mRNA düzeylerini belirlemek için bir tesis örnekleri gönderin. Belirli mRNA&#39;lanmn çevirisi RT-qPCR tarafından izlenecek gerekiyorsa, bu cDNA sentez (&gt; 3 ribozomlan veya toplam RNA içeren toplanmış fraksiyonları) RNA 500 ng kullanmanız tavsiye edilir. Not:&gt; 3 ile ilişkili mRNA ribozom verimli şekilde çevrilmiş mRNA temsil eder ve yeni sentezleyebilen arasında% 80&#39;den fazla içeren isteğe bağlı olarak ayarlanırölçekli polipeptidler 28,29. (1-2) ışığa tekabül eden fraksiyon, ortamında (2-3) ve ağır polizom dahil (&gt; 3) bu şekilde avantajlı olacaktır, ancak bu (koşul başına 2 vs 4) 2-kat örneklerin sayısını artacak ve Deneyin maliyeti. Gelecekte de bu derin sıralama ve mikroarray analizi maliyet azalması, ikinci bir yaklaşım tercih etmesi gerektiğini tahmin olduğunu rağmen, bu doğrulama sırasında, bireysel mRNA&#39;lanmn dağılımı her fraksiyonunda izlenir tavsiye edilir. </li></ol> MRNA Çeviri 4. Genom analizi <ol><li> Kurulum R, BioConductor ve ANOTA paketi: <ol><li> R (r-project.org indirilmektedir) takın ve bir R-oturumu başlatın. Not: R tüm işletim sistemleri için mevcuttur ve ANOTA hepsinin üzerinde çalışacaktır. </li><li> Bioconductor takın (bioconductor.org). Do tarafından başlatılan - R kod Windows R-terminali (örneğin R konsol üzerinden yorumlanıruble) R kısayolu tıklayarak. BioConductor (R-terminali) yazarak yüklenir: kaynağı (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite () </li><li> (R-terminali) yazarak ANOTA BioConductor paketi (ve ANOTA gerektirir qvalue paketi) yükleyin: kaynağı (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite (c (&quot;ANOTA&quot;, &quot;qvalue&quot;)) </li><li> Paket başarıyla yüklenmiş ve (R-terminali) yazarak ANOTA kılavuzunu açmak olduğunu Testi: kütüphane (&quot;ANOTA&quot;) skeç (&quot;ANOTA&quot;) </li><li> Not: ANOTA paketinde kullanılan tüm işlevleri için ek yardım ANOTA web sayfasında (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) de kullanarak veya bulunabilir Örneğin R. içinde yardım fonksiyonu, anotaPerformQc fonksiyonu hakkında yardım almak için R-te gitmekrminal ve tipi (ANOTA paketi yüklendiğinde bu yalnızca çalıştığını unutmayın): kütüphane (&quot;ANOTA&quot;) # ANOTA paketini yükler ? AnotaPerformQc # Bu işlev için yardım penceresi </li></ol></li><li> R ithalat verileri: <ol><li> Ekspresyon verileri analiz için hazırlayın. Veriler, mRNA seviyelerini ölçmek için kullanılan teknik ile ilgili olarak (örneğin, normalize edilmiş ve kalite kontrol) ön işleme tabi tutulmalıdır. Log2 giriş değerleri log, dönüştürülmesi gerekir en yaygın olanıdır. Tüm Polizomdan ilişkili RNA örnekleri ve sitosolik RNA numuneleri için biri için veri ile bir tablo derlenir. İlk sütun, numune başına bir veri sütunu, ardından gen-tanımlayıcıları içermelidir; ilk satır örneklerin adlarını içermelidir. Bu tablo aynı numune sipariş ve aynı gen düzen olması önemlidir. &quot;MyPolysomeData.txt&quot; ve &quot;myCytosolicData.txt&quot; adlı sekme ile sınırlandırılmış metin dosyaları gibi dosyaları kaydedin. </li><li> C1, C2, C3, D1, D2, her ikisi de myCytosolicData.txt ve myPolysomeData.txt dosyalarında D3: Bu örnekte, iki örnek sınıfları, böylece bu sırada 6 örnekleri üreten, sınıf başına 3 kez tekrarlanmış olan (kontrol veya hastalıklı) kullanılır. Iki örnek sınıflar varken ANOTA durum başına en az 3 suret gerektirir. Bu bağımsız biyolojik çoğaltır olmalıdır. </li><li> Veri girişi dosyalarını (myPolysomeData.txt ve myCytosolicData.txt) içeren bir dizin oluşturun. Bu dizinden açık R. Windows / Mac, bu dizine bir R-kısayolu kopyalama ve bu kısayolu kullanarak R başlatarak yapılabilir (doğrudan çalışan da açılan menüleri kullanarak değiştirilebilir). </li><li> Yeni oluşturulan dizin içinde myCode.R adında bir dosya oluşturun ve bir metin düzenleme yazılımını kullanarak açın. Bu dosyadaki kod yazın. </li><li> R içine veri yüklemek için (her kod eklenmesinden sonra yeniden kaydedin bu dosyayı unutmayın) myCode.R dosyasına aşağıdaki kodu yazmak. Aşağıda adım-skod ama tüm kod dım açıklama da sadece bir kez kullanılabilir (aşağıda bakın, kod çalışır) başlangıçta ve kaynak işlevi yazılabilir: # # Bu ANOTA kütüphane yükler kütüphane (ANOTA) # # Bu R içine girdi verilerini yükler dataCyto &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myCytosolicData.txt&quot;, header = DOĞRU, row.names = 1, Eylül = &quot; t&quot;)) dataPoly &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myPolysomeData.txt&quot;, header = DOĞRU, row.names = 1, Eylül = &quot; t&quot;)) </li><li> R terminaline doğrudan yazarak R kodu çalıştırın: kaynağı (&quot;myCode.R&quot;) </li><li> Veri (R-terminal içine) yazarak başarıyla yüklendiğini kontrol edin: kafa (dataCyto) # dataCyto tablonun üst gösterecektir kafa (dataPoly) </li></ol></li><li> Farklı olarak tercüme genlerin tespiti: <ol><li> Tanımlayan bir vektör oluşturmakörnek kategoriler (bir vektör R nesne türüdür). Üç nesneler örneklerin benzer bir düzen var ki, bu vektör myPolysomeData.txt ve myCytosolicData.txt örnek düzeni yansıtmalıdır. Örnekler karşılaştırma hangi ANOTA yönlendirilmesi sırasında vektör kullanılır. MyCode.R dosyasına aşağıdakileri ekleyin: # # Suret numuneler aynı numune sınıf var unutmayın # # Açıklamaları bu vektör (yani, &quot;C&quot; ve &quot;D&quot;). myPhenotypes &lt;- C (&quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;) </li><li> Veri kümesinin kalite kontrol yapın. ANOTA analizi için kullanılmadan önce değerlendirilmesi gereken kaliteli bir dizi önlem vardır. Bunlar ANOTA el kitabında ayrıntılı olarak tartışılmıştır. MyCode.R dosyasına bu kodu ekleyin ve kaydedin: anotaQcOut &lt;- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut &lt;- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> R-terminal içine yazarak kodu çalıştırın: kaynağı (&quot;myCode.R&quot;) Bu ANOTA kılavuzunda anlatıldığı gibi incelenebilir çıkış dosyalarının bir dizi üretecektir. </li><li> Farklı şekilde tercüme genleri tanımlamak. Numuneler onlar (&quot;tezat&quot; parametresini kullanarak) kullanıcı tarafından belirtilen sürece (&quot;myPhenotypes&quot; vektör yani) &quot;phenoVec&quot; parametresine verilen isimlerin alfabetik sırasına göre mukayese edilecektir. Içeride &quot;kaynak&quot; komutunu kullanarak dosya ve bitiş myCode.R için aşağıdaki kodu ekleyin R-terminali, yukarıda açıklandığı gibi: anotaSigOut &lt;- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> AnotaGetSigGenes anlamak için yardım kullanabilirsiniz nasıl oıkış biçimlendirilmiş ve (R-terminali) yazarak karşılaştırmak için örnek kategorileri seçmek için nasıl edilir: ? AnotaGetSigGenes </li><li> Farklı şekilde tercüme edilir Filtre ve arsa genler. AnotaPlotSigGenes fonksiyon içinde uygulanabilir ve yardım kullanarak bu tür eşikleri özel bir birleşimini kolaylaştırmak olacaktır birden eşikler vardır. Güvenilir bir şekilde analiz genleri seçmek için minSlope (-0.5), maxSlope (1.5) ve slopeP (0.01) ayarları uygulanır. Not: Ayrıca, RVM 23,26,30 yanlış keşif oranı (FDR) (0.15) için geçerli ayarları ve (log2 [1,5]), örneğin farklı şekilde tercüme genleri tanımlamak için kullanılır olabilir değişiklikleri katlayın. Örneğin &quot;selDeltaPT&quot; gibi diğer filtreler ([1,5] log2 için selDeltaPT ayarı gibi) katı bir filtreleme için yararlı olabilir. Bu karşılaştırma (selCont argüman kullanarak) filtre edilmelidir belirtmek için de gereklidir. MyCode.R için aşağıdaki satırı ekleyerek açıklanan ayarları uygulayındosyası: anotaSigFiltered &lt;- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0.5), = 1.5 maxSlope, slopeP = 0.01, maxRvmPAdj = 0.15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5)) </li><li> Kaynak fonksiyonunu kullanarak analiz yapma R-terminal yukarıda tarif edildiği gibi. Bu aynı zamanda bir grafik çıktı üretecektir. Bu çıkışı inceleyerek analiz performansını değerlendirmek ve ayarlarında gerekli değişiklikleri tanımlamak için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. </li><li> Bir çıkış tablosu oluşturun. MyCode.R dosyasına aşağıdaki kodu ekleyin: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = &quot;MySignificantGenes.txt&quot;, Eylül = &quot; t&quot;) </li><li> R-terminalinde kaynak işlevini kullanarak kodu çalıştırın. Çıkan tabloda sütunlar anotaPlotSigGenes fonksiyonu için yardım açıklanmıştır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes:+a+systems+biology+view.">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li><li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells.">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases.">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li><li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways.">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation.">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li><li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease.">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer:+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways.">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li><li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease.">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li><li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+neurodegeneration:+role+and+impact.">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li><li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease.">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments.">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li><li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells.">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li><li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1.">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li><li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide.">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li><li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome.">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li><li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+translational+control+in+CD4++T+cell+subsets.">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13 (2013).</li><li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis.">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li><li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins.">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li><li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Bu makalede, memeli hücrelerinde bir genom ölçekte öteleme aktivitesinde nitel ve nicel değişiklikleri yakalamak için bir in-house geliştirilen analiz yöntemi ardından köklü bir Polizom fraksiyon protokol tanımlamaktadır. Bu protokol özel ilgi başarıyla tamamlanması 1) Hücre confluency dikkat edilmelidir için çoğalma hızları ve besin durumu mRNA çeviri aktivitesi ile ilişkili ve translatome bileşimini etkileyebilir olarak (hücre konfluensisinin) çoğaltır ve deneysel koşullara tutarlı olmalıdır, 2) Hızlı hücre liziz (sikloheksimid ve tamponlar içinde RNAse inhibitörlerin varlığında rağmen, hızlı liziz ve hücre ekstreleri hemen RNA bozulması ve polizom ayrılmasını önlemek için liziz sonra sukroz dereceleri üzerinde kaplanmış olmalıdır) olmalıdır, 3) Gradient hazırlanması (sağlamak yüksek veri uyarlık, sukroz geçişlerini degrade makinesi ve SPE kullanılarak hazırlanmalıdır) onları işlerken cial dikkat edilmelidir. Translasyonel aktivitesindeki değişiklikleri okuyan ek olarak, bu protokol, ribozom-ilişkili protein komplekslerini izole etmek ve bunların fizyolojik fonksiyonları oluşturmak için kullanılabilir. Ribozom-ilişkili protein kompleksleri gradyan fraksiyonlardan immünopresipitasyon ve Western blot analizi ya da kütle spektrometresi ile analiz edilebilir ise, bu amaca yönelik olarak, düzeyleri ve çeşitli ribozom-ilişkili proteinlerin fosforilasyon durumu, TCA presipitasyonu ile belirlenebilir Western blotting ile izledi. Bu tekniğin bir eksiklik yavaş degrade fraksiyon yöntem bağlanma kinetiği hızlı bir birleşme / ayrılma içinde olsa bile sıkı bir şekilde bağlanmış protein ayrışma neden olmasıdır. Yeni sentezlenmiş polipeptidlere ilişkili faktörler tipik örneklerdir. Ribozomlar oluşturan yeni ortaya çıkan sentez polipeptidler, 3 gibi kimyasal çapraz-bağlayıcıların kullanımı ile ilişkili ribozom protein kompleksleri üzerinde hareketsiz olabilir, 3&#39;-ditiyobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Bu yaklaşım ortaya koydu Aktive C Kinaz 1 (Rack1) / c-Jun N-terminal kinazın (JNK) / ökaryotik için uzama faktörü için reseptör 1A2 (eEF1A2) kompleksi 27 strese tepki olarak yeni sentezlenmiş polipeptidlerin bozulmasını düzenleyen. Buna ek olarak, benzer metodoloji, protein kinaz C BII (PKCbII) bu yeni sentez AKT polipeptidler fosforile eder ve düzenler, ribozomlar üzerinde meydana Rack1 32 ve mTOR kompleksi 2 (mTORC2) bu aktivasyonu ile ribozomlara işe olduğunu gösteren çalışmalar kullanılmıştır onların istikrar 33,34. ANOTA analizi ile takip polisom ayırma yönteminin başlıca sınırlamaları şunlardır: hücrelerin nispeten yüksek sayıda (~ 15 x 10 6 hücre) için 1) gereksinimi, 2), belirli bir mRNA molekülü üzerinde ribozom konumuyla ilgili konumsal bilgi eksikliği ve 3 Hücresel ve moleküler hetero ile ilgili) sorunlarNormal ve tümör dokular geneity. Gerekli hücre sayısı ile ilgili konular miktarlarının yüksek-bereket hücrelerinden elde edilen (örneğin HeLa hücreleri) 35 ile sınırlayan hücrelerin monosomes (80S) karşılık gelen absorbans spektrumları zirveleri hizalayarak çözülebilir. , Insan dokuları gibi karmaşık sistemlerinden elde edilen gen ekspresyonunda değişikliklere yorumuna doku heterojenlik karıştırıcı etkileri ile ilgili konular ele oysa ribozom profil oluşturma tekniği (aşağıya bakınız), belirli bir mRNA molekülü üzerindeki ribozom tam konumunu belirlemek için kullanılabilir Leek ve Storey 36 ile bir yayında ayrıntılı olarak. Ribozom korumalı parçaları (RPFS) RNAse I muamele ile üretilir ve derin 22-dizisi ile analiz edilir, burada en son profile tekniği yeni bir ribozom, geliştirilmiştir. Bu teknik, bu şekilde şimdiye kadar UNPR sağlayan, tek bir nükleotid çözünürlükte ribozom pozisyonunun belirlenmesini sağlar:ribozom biyoloji içine ecedented anlayışlar. Örneğin, ribozom profil belirli bir mRNA molekülü veya elemanların tanımlanması üzerine ribozom yoğunluğunun belirlenmesi için kullanılabilecek bu tür alternatif başlangıç ​​yerleri, non-AUG başlatma kodonu ile ve bu uORFs gibi düzenleyici elemanları olarak etki çeviri başlangıç ​​oranları. Ancak, doğru mRNA çeviri etkinliğini tahmin etmek ribozom profilleme yeteneğini kısıtlayan çeşitli metodolojik sınırlamalar vardır. Bunlar rastgele parçalanması ve RNAz ben sindirim tarafından tanıtıldı bağımsız önyargıları dahil, çeviri inhibitörleri (örneğin emetine ve Siklohekzimidsiz gibi örneğin uzama inhibitörleri çeviri başlatma sitelerinde ribozom birikmesine sebep muhtemeldir) tarafından tanıtılan önyargıları, yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçların çok sayıda ilişkili TE puan olarak tahmin onların yanlışlığına ile bu protein kodlama mRNA&#39;lardan 37 kaynaklanır okur. Belki de en önemlisi, oysaribozom profil belirli bir mRNA molekülü üzerinde ribozom pozisyonunun doğrudan belirlenmesini sağlar, belirli bir mRNA ile ilişkili ribozom sayısının dolaylı olarak, toplam (rastgele bölünmüş mRNA gözlenen fazla RPFS (ribozom ile ilişkili mRNA) okur frekansları normalize edilmesi ile tahmin edilmektedir mRNA). Örneğin, dört &quot;B&quot; mRNA molekülleri (Ba, Bb, Bc ve Bd) pozisyon 1, 2, 3 ve 4, ribozom profil oluşturma tekniğinin doğal bir dezavantajı dört ribozomlar tarafından işgal edilmiştir basit bir ortamda izin vermez Bir bütün 4 ribozomlar pozisyonlarda 1 bir Ba mRNA sadece ilişkilendirmek senaryoda, 2, 3, ve 4 ve Ba, Bb, Bc ve Bd mRNA pozisyon 1, 2 tek bir ribozom tarafından her işgal bir senaryo arasında bir ayrım , sırasıyla 3 ve 4,. Bunun aksine, polisom parçalama sırasında Polizom bütünlüğü bu şekilde ribozom tanımlanmış bir dizi (Şekil 1) ile ilişkili mRNA havuzlarının izolasyonunu sağlayan, korunur. Bu ithalatPolizom fraksiyonasyon ve ribozom profil arasındaki fark ant eski Yöntem, mRNP in mRNA karşılaştırmak için kullanılabilir ise, hafif ve ağır Polizom fraksiyonlar, ikinci yöntem olası mRNA kaynaklanır translatome değişiklikleri yakalamak başarısız olur göstermektedir ki geçiş dan ağır polisomlar için mRNP fraksiyonu kayması olanların katkısını overestimating ederken, ağır polisomlar için yanar. Anılan yöntemler arasında bu farkların biyolojik önemi gibi eIF4E duyarlı olanlar gibi mRNA&#39;lanmn bir alt kümesi olduğunu öteleme aktivasyonunu gösteren verilerin büyük bir organ tarafından çizildi, gibi gibi diğerleri barındıran ağır polisomlar ışıktan geçiş, oysa 5&#39;TOP elemanları, doğrudan ribozomsuz mRNA 6 havuzları ağır polisomlar için işe alınırlar. İlginç bir şekilde, mTOR yol eş zamanlı &quot;eIF4E duyarlı&quot; ve 5&#39;TOP 1 mRNA translasyonunu modüle ettiği gösterilmiştir1.. Nedenle, yukarıda açıklanan metodolojik farklılıklar translatome üzerinde mTOR inhibisyon etkilerini değerlendirmek için 38,39 ve Polizom damıtılmalarının 24 profilleme ribozomu kullanarak çalışmalar arasındaki sonuç belirgin uyumsuzluğuna açıklayabilir. Sonuç olarak, polisom ayırma ve ribozom profil temel olarak, sırasıyla mRNA, mRNA üzerinde ve ribozom konumu ile ilişkili ribozom sayısı ile ilgili bilgi sağlayan tamamlayıcı yöntemlerdir. Önemlisi, bu yöntemlerin eksiklikleri ve avantajlarına rağmen, her iki prosedürler ile elde genom veri yeterince analiz ve fonksiyonel ve biyokimyasal doğrulandığı esastır kalır.

Gen ekspresyonunu kontrol eden düzenleyici ağlar yaygın son iki yıl içinde incelenmiştir. Bir genom ölçekte sabit durum mRNA düzeylerindeki değişiklikler sözde &quot;gen ekspresyon&quot; profillerini belirlemek için kullanılan sayede transkripsiyonel regülasyonu, odaklanmış bu araştırma çabalarının büyük çoğunluğu. Son çalışmalar, sabit durum mRNA seviyeleri sadece gevşek bir şekilde ve böylece mRNA çevirisi de dahil olmak üzere transkripsiyon sonrası mekanizmaları, gen ifadesinin 3,4 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını gösteren, proteomun 1,2 bileşimine uygun olduğu ortaya çıkmaktadır. Gerçekten de, ~ protein seviyelerinin% 50 ölümsüzleştirilmemiş fare fibroblastlarında 5 mRNA çeviri seviyesinde belirlenir olduğu tahmin edilmiştir. mRNA çeviri mRNA&#39;ları düzenledi ribozomlar, transfer RNA&#39;lar (tRNA&#39;lar) eylem ve aksesuar faktörler işbirliği yoluyla proteinlere çevrilir sırasında oldukça düzenli bir süreçtirmmonly için faktörler (TF) 6 olarak adlandırılır. Protein sentezi memeli hücrelerinde 7 en fazla enerji tüketen bir süreçtir ve bu nedenle küresel mRNA kurları besin durumunu ve hücre çoğalma oranları 8 barındıracak şekilde ayarlanır. Global mRNA çevirisi oranları, çeşitli hücre dışı uyarımlar (örneğin, hormonlar ve büyüme faktörleri), hücre içi olaylara (örn., amino asit seviyeleri) ve stres farklı türde (örneğin, ER-stres) olan mRNA&#39;ların havuzlarında seçici değişikliklere neden değişikliklere ek olarak (translatome) 6 tercüme ediliyor. Uyarıcı tipi, bir çeviri aktivitesi değil, tüm mRNA ve böylece önemli ölçüde hızlı bir hücre tepkisini 6 monte etmek için gerekli olan proteomun değişikliklere neden etkilenir bağlı olarak değişir. Translatome bu nitel ve nicel değişiklikleri trans-etkili faktörler arasındaki etkileşimi (aracılık düşünülmektedir örneğin </em&gt; öteleme makine, yardımcı faktörler ya miRNAs) ve mRNAlarının 6,9 seçilmiş alt kümelerinde bulunan sis-elemanlarının (RNA unsur veya özellik) bileşenleri. Örneğin, seviyeleri ve / veya hız sınırlayıcı bir çeviri başlatma aktivitesindeki değişiklikler eIF4E elF2 ve seçici olarak spesifik özellikleri 6 5 &#39;UTR göre transkriptlerinin çevrilmesini modüle eden faktörler. eIF4E ve elF2 sırasıyla 6, ribozoma mRNA ve başlatıcı tRNA alımı için gereklidir. EIF4E aktivitesinde bir artış, seçici bir siklinlerin, c-myc ve Bcl-xL 10 dahil olmak üzere, proteinleri uyararak kodlayanlar proliferasyonu ve hayatta kalma dahil olmak üzere uzun ve yüksek yapılı 5&#39;UTRs barındıran mRNA translasyonunu güçlendirir. Buna karşılık, elF2 inaktivasyonu seçici bir şekilde olanlar gibi bir kodlama ana t olarak 5&#39;UTRs kısa önleyici baş taraftaki açık okuma çerçevelerini (uORFs) ihtiva eden mRNA translasyonunu ayarlar iken, genel bir protein sentezi kapatılmasına yol açarAçılmış protein tepki (örneğin ATF4) arasında ranscriptional regülatörleri. Besin maddeleri, büyüme faktörleri ve hormonları, rapamisin mekanistik / hedef memeli MAPK yolağı, doğrudan fosforile eder, oysa (mTOR) yolunun, 4E bağlayıcı proteini için bastırıcılarının (4E-BP) ailesi tarafından inaktive eIF4E aktivitesini uyaran dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara karşı yanıt olarak 6,11 eIF4E. Buna karşılık, eIF2α kinazlar (örneğin dikmek PKR, HRI ve GCN2) besin yoksunluğu, ER-stres ve virüs enfeksiyonu 6,12 tepki olarak eIF2α düzenleyici alt birimi tarafından fosforile elF2 inhibe eder. TF&#39;lerin aktivitesi ve / veya ifade değişiklikler, translasyon makine ve miRNAs dahil olmak üzere düzenleyici faktör diğer bileşenleri, kanser, metabolik sendromlar, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklar, böbrek ve kalp-damar hastalıkları 13-19 dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlarda gözlenmiştir. Topluca, bu veriler beni Ötelenmeli göstermektedirchanisms hücre vücut dengesinin sürdürülmesinde ve bunların kaldırılması çeşitli insan hastalıklarının etiyolojisinde rol oynadığı çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, monosomes, ribozomal alt birimlere ve haberci ribonükleoprotein parçacıklar (mRNPs) için polizom ayırmak için kullanılan memeli hücrelerinde sükroz yoğunluk gradyan santrifüj ile polizom paya ayırma için bir protokolü tarif edilmektedir. Bu kötü tercüme (ışık polisomlar ile ilişkili) mRNA&#39;lardan (ağır polisomlar ile ilişkili) verimli şekilde çevrilmiş arasında ayrımcılık sağlayan. Bu deneyde, örneğin ribozom sikloheksimid 20 ve sitosolik özütler ultra-santrifüj ile% 5-50 doğrusal sakroz yoğunluk gradyanları üzerinde ayrılmıştır gibidir için uzama inhibitörleri kullanılarak, mRNA üzerinde immobilize edilir. Sukroz meyilleri daha sonraki ayırma bunlar bağlanan ribozom sayısına göre mRNA izolasyonunu sağlar. Her bir fraksiyondan ekstre RNA daha sonra belirlemek için kullanılabilirfarklı durumlar arasında degrade boyunca mRNA&#39;lann dağılımları değişiklikler, bu sayede degrade alt üst öteleme verimi artar. Northern Blot veya kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) her fraksiyonda mRNA seviyesini tespit etmek için kullanılır. Seçenek olarak ise, ağır polisomlann (tipik olarak en fazla 3 ribozomlar) ihtiva eden fraksiyonlar bir araya getirilmiş ve genom Polizomdan ilişkili mRNA düzeyleri mikro-dizisinin veya derin-dizilemesi kullanılarak belirlenir. Bu Polizomdan ilişkili mRNA seviyeleri sitosolik mRNA seviyeleri 21 etkileyen transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası mekanizmaları tarafından etkilenen, çeviri ek olarak olduğunu vurgulamak için büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, Polizomdan ilişkili mRNA&#39;dan genom verileri kullanılarak çeviri farklılıkları belirlemek it transla üst akışında olan gen sentezleme yolundaki adımlardan etkilerinin düzeltilmesi için gerekli olantion 21. Böyle bir düzeltme sağlamak için, sitozolik RNA 21, belirlenen her bir numuneden Polizomdan bağlantılı RNA ve genom sabit durum mRNA seviyeleri ile paralel olarak hazırlanır. Şu anda, &quot;çeviri verimliliği&quot; (TE) değerleri olarak adlandırılan (Polizomdan ilişkili mRNA verileri ve sitosolik mRNA verileri arasındaki log oranı ie) genellikle bir çeviri verimliliği sitosolik mRNA düzeylerindeki değişimlerin etkilerini gidermek için kullanılmaktadır mRNA 22 Verilen. Bununla birlikte, ayırıcı çeviri tespit etmek TE puanları kullanarak nedeniyle genel olarak yapay bir korelasyon 27 de ifade TE puan matematiksel bir özelliğine yanlış pozitif ve negatif bulgular önemli numaraları ile ilişkilidir. Nitekim birden laboratuarlarında veri setleri bir anket gibi sahte korelasyon translatomes 23 değişiklikleri analiz zaman kaçınılmaz gibi görünüyor belirtti. Bu diferansiyel tr &quot;analizi geliştirilmesini teşvik<html> anılan eksikliklerin 23 muzdarip değil anslation &quot;(ANOTA) algoritması. ANOTA-analiz sırasında bir regresyon modeli sitosolik RNA seviyeleri bağımsız translasyon etkinliğinin önlemler elde etmek için kullanılır. Bu tür önlemler, daha sonra koşullar ve istatistik hesaplanır arasında karşılaştırılmıştır. Kullanıcı istatistiksel gücünü artırır ve birkaç çoğaltır 24 ile yapılan çalışmalarda yanlış pozitif bulgular oluşumunu azaltan bir varyans çekme yöntemi, uygulama seçeneği vardır. Önemli ölçüde, son zamanlarda translatome içinde tedirginlikler ANOTA tarafından yakalandı gösterdi, ama TE değil puanları, proteomun 25 değişiklikler ile ilişkilidir. Bu nedenle, son derece bir genom ölçekte çeviri değişikliklerin belirlenmesi için ANOTA analizi uygulanması tavsiye edilir. ANOTA algoritmasının teorik temeller önce 21,23,26 ayrıntılı olarak ele iken, burada odak pratikte bunu uygulamak nasıl olduğunu. hücrede mRNA için aktivitesinde değişiklikler okuyan ek olarak ve_content &quot;&gt;, bu ribozom ayırma protokol izole edilmesi ve biyokimyasal olarak ve fonksiyonel olarak ribozom ve Polizomdan ilişkili protein kompleksleri karakterize etmek için kullanılabilir. bu yaklaşımın başarılı bir şekilde tanımlamak için geçmişte dağıtıldıktan Yeni sentezlenmiş polipeptidler 27 ve / veya translasyonel makine bileşenlerinin fosforilasyonu katılan stabilitesini düzenleyen kompleksleri. polisom ayırma yönteminin bu uygulama aynı zamanda kısaca ele alınacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

mRNA çevirisi gen ekspresyonunun düzenlenmesinde merkezi bir rol oynar ve memeli hücrelerinde en az enerji tüketen işlemi temsil eder. Bu duruma göre, mRNA çevirisi düzensizliği kanser dahil olmak üzere patolojik durumların bir çok önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Ribozomlar da böylece fonksiyonu ve yeni sentezlenmiş polipeptid istikrarı modüle, doğmakta olan polipeptidlerin katlanmasını kolaylaştırmak kaperonlar, ev sahibi. Ek olarak, ortaya çıkan veriler ribozom sinyal bunlar ribozom ortaya olarak yeni sentezlenmiş polipeptitlerin translasyon sonrası modifikasyonların çeşitli karıştığı molekülleri, ve / veya translasyonel makine bileşenlerinin bir repertuar için bir platform olarak hizmet göstermektedir. Burada, sükroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak ribozom damıtımı köklü bir yöntem tarif edilmektedir. In-house geliştirilen &quot;ANOTA&quot; algoritması ile birlikte bu yöntem sağlar diffe doğrudan tayinininbir genom ölçekte bireysel mRNA&#39;lanmn rential çeviri. Ayrıca bu çok yönlü protokol yeni sentezlenmiş polipeptidlerinin katlama ve bozulma merkezi bir rol oynadığını, bu dahil olmak üzere, ribozom-ilişkili protein kompleksleri, işlevini incelemek amacıyla biyokimyasal çalışmalar çeşitli için kullanılabilir.

mTOR besin durumu 19 ile küresel protein sentezi oranlarını koordinatları hücresel ağın önemli bir düğümdür. mRNA için oran-sınırlayıcı başlangıç ​​aşamasında 6 ağırlıklı olarak düzenlenir. Polisomlar yapan Ribozomların oranı olumlu çeviri başlangıç ​​oranları 28 ile ilişkilidir. MRNA çeviri üzerine insülinin etkilerine aracılık mTOR sinyal rolünü araştırmak için polisom damıtma yöntemi uygulayarak bir örnek sunulmaktadır. Bu amaçla, MCF7 insan meme kanseri hücreleri, düşük serum içinde tutulur ve daha sonra insülin tek başına ya da aktif yer mTOR inhibitörü Torin1 ile kombinasyon halinde ile uyarılır. Sürekli düşük serumda tutuldu, uyarılmamış hücreler, bir kontrol olarak kullanılmıştır. mRNPs, monosome (80S) ve Polizom fraksiyonlar polisom ayırma yöntemi kullanılarak ayrıldı. Kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, ilgili ensülin gradyan fraksiyonlarında absorbans bir artışa nedenpolizom için, monosome fraksiyonda absorbans bir azalma eşlik eden (Şekil 1) ile birlikte. Bu bulgular, polizom yapan ribozomların oranı bu nedenle beklendiği gibi, ensülin küresel çeviri başlatma oranlarını uyarır, belirten, kontrol hücrelerine kıyasla tedavi edilen insülin artmış olduğunu göstermektedir. Torin1 böylece mTOR sinyal nakil mekanizması 19 insülin etkisini aracılık etmede önemli bir rol oynadığını bulguları teyit edici, emme profilleri insülin etkisini (Şekil 1) tersine dönmüştür. Gradyan hazırlık tutarsızlıklar kaçınılması mümkün olmayan bir inanç dayanarak, sorular polisom fraksiyon yöntemi 22 kullanılarak elde edilen verilerin tekrarlanabilirliği ile ilgili gündeme edilmiştir. Ampirik bu potansiyel zararlı sorunu, sitozolik ve ağır Polizomdan ilişkili RNA (4 ve daha fazla ribozomlarla ilişkili mRNA) test etmek için izole edildi<html> 4 bağımsız biyolojik tekrarlanmış Torin1 (Şekil 2) ile kombinasyon halinde, tek başına insülin ya da insülin ile tedavi MCF7 hücreleri. Sitosolik ve her deney ağır Polizomdan ilişkili mRNA bileşimine insülinin ve Torin1 etkisi, bir mikro-dizi yaklaşım kullanarak bir genom geniş bir ölçekte belirlenmiştir. Temel bileşen analizi (PCA) uygulandı polisom bölme yönteminin tekrarlanabilirliği belirlemek için. Bu tür bir analiz, farklı koşullar de (Şekil 2) ayrılmıştır sırasında her bir durum ait örnekler sıkıca ilk iki bileşenleri içinde konumlandırılmış olduğunu gösterdi. Bu bulgular, burada açıklandığı gibi, polisom ayırma yöntemi oldukça üretilebilir ve bir genom düzeyinde çeviri niceliksel ve niteliksel değişiklikleri incelemek için, bu nedenle uygun olduğunu göstermektedir. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Serum açlık insülin ve mTOR MCF7 hücrelerinde küresel çeviri üzerine sinyal etkisini gösteren Şekil 1,. Polysomal profilleri. MCF7 hücreleri, 16 saat süre ile (% 0.1 FBS içinde tutulan) besin yoksun bırakıldı ve 5 nM insülin (In), tek başına ya da tedavi edildi 4 saat için 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Sürekli besin (% 0.1 FBS) yoksun olan Tedavi edilmeyen hücreleri, kontrol olarak kullanılmıştır. Karşılık gelen sitosolik özütler% 5-50 sakaroz gradyanları üzerinde santrifüjle çöktürülmüştür. Ücretsiz ribozomal alt birimleri (40S ve 60S), monosomes (80S) ve polisom fraksiyonlardaki ribozomların sayısı belirtilir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Şekil 2.. P kullanılarak elde edilen genom veriolysome profil çok tekrarlanabilir. MCF7 hücreleri. Sitosolik ve Polizomdan bağlantılı RNA (&gt; 3 ribozomlar) GeneTitan diziler (Affymetrix) kullanılarak belirlendi 4 bağımsız biyolojik çoğaltır ve genom mRNA düzeyleri elde edilmiştir, Şekil 1 &#39;deki gibi muamele edilmiştir. PCA edilen veriler tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için kullanıldı. RNA kökenli (C = sitozolik, P = Polizomdan ilişkili) tüm tedaviler için ilk iki PCA bileşenleri (;; ctrl = kontrol Atışı = insülin T1 = Torin 1) gösterilmiştir ve çoğaltır. Aynı durum ve RNA kaynaklı örnekler yakın yüksek bir tekrarlanabilirlik göstermektedir konumlandırılır.

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

polysome-fractionation-analysis-mammalian-translatomes-on-genome-wide

Research

JoVE Journal

Biology

68.2K Görüntüleme.  McGill University.  Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir. 

Video: Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Biyoloji

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

Yeni çok katmanlı bir balon kullanarak Memeli Hücre Kültürü Ölçeği-Up

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

Çeşitli ChIPseq Veri Türleri Genom çapında Analizi İçin Yeni Bir Bayesian değiştir nokta Algoritması

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler