Biz birçok yararlı tartışmalar için Yves Couder özel şükrediyoruz. Biz dirseklerin ve tartışma kalibrasyonu için Aymen Asnacios teşekkür ederim. Biz eleştirel okuma Lisa Willis, Elliot Meyerowitz ve Oliver Hamant teşekkür ederim. Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0062/2005-C tarafından kısmen finanse edildi; Agence Nationale de la Recherche&#39;&#39;&#39;&#39; Growpec&#39;&#39; ve&#39;&#39; Mechastem projeler.

1.. Örnek Montaj için cam slaytlar hazırlayın <ol><li> Agaroz ortam gömülmesinin hazırlanması:% 10 manitol (su içinde) içinde% 0.7 düşük erime noktalı agaroz. </li><li> Güçlü bir metal alet (örneğin matkap ucu, kireç) kullanılarak, bir mikroskop cam slayt merkezinde 0.5 x 0.5 cm bölgeyi etch. Veya bunun yerine, Araldite yapıştırıcı kullanarak cam slayt cam yapraklardan (yaklaşık 20 x 200 mm) küçük bir parça tutkal. Not: Bu sağlamak için agaroz yapışmasını kolaylaştırmak amacıyla yüzeyi pürüzlü olduğu slayt agaroz ortam çubukları ya da giderir. Bu slayt yeniden kullanılabilir. </li><li> Cam slayt kazınmış bölge üzerine agaroz ortam gömülmesinin yaklaşık 20 | il bir damlacık yerleştirin. Bu agaroz ince bir film oluşturur. </li><li> Nemli bir kutu içinde cam slayt saklayın ve agaroz medya katılaşması için bekleyin. </li></ol> 2.. Meristem Örnekleri Diseksiyon ve Montaj <ol><li> Konfokal IMAGI için Microdissect meristemlering: ultra ince cımbız ile onları aşağı çekerek sapından çiçek tomurcukları tek tek kaldırın. Bu (P1 primordia 14 yani) sepals ememeyen tomurcukları tüm çiçek tomurcukları kadar kaldırmak için önemlidir. </li><li> Bir jilet veya cımbız ucu kullanarak, uzak sapından meristemi kesti. Kesilen AFM ile ölçülecek olan meristem yüzeyinin bölgesine paralel olmalıdır. Elde edilen apeks 300 um ve AFM ucu altında uygun yüksek 600 mm arasında olmalıdır. </li><li> Aşama 1.1.4 hazırlanan agaroz ortam filmin içine tepe itin. Cam slayt / agaroz bir pozisyon seçin ve meristem cam slayt ile temas hem de doğrudan ve agarozdan dışarı çıkıntı nazikçe böyle itin. Bu kök onun kesim takip birkaç saniye içinde agaroz meristemi konumlandırmak için çok önemlidir. Not: Bu kurutma gelen meristemi önlemek için olan. Bu aşamada, bir meristem CRAC ayakta edilecektirAgaroz basınç uygulanması üzerine kırık nedeniyle k. </li><li> Onlar aynı yükseklikte ve tek slaytta diğerinden az 500 mikron konumlandırılmış şartıyla, birkaç meristemleri toplu görüntüleme için bu şekilde hazırlayın. Bundan başka örnekleri kesme sırasında nemli kutu içinde hazırlanan meristemleri tutun. NOT: Bu kalibrasyon gelen değişimi sınırlayan. Her durumda, ideal olarak 2 örnekler hazırlanmış ve rasgele ölçülebilir. Şimdiye kadar ölçüm (stres kaynaklı cevap) toplu görüntüleme gözlenen herhangi bir etkisi yoktur. Bu agar ve / veya montaj çözelti içinde stres sinyal molekülleri seyreltme sayesinde olabilir. Alternatif olarak, stres tepkisi ne olursa olsun, hazırlanmış bir numune miktarı aynıdır. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, meristem ve çiçek tomurcukları arasındaki sınır kuru olduğundan emin olun. Değilse, hafifçe filtre kağıdı kullanılarak fazla su çıkarmak. Bu erimiş bir sonraki aşamada engellemelidiragaroz nedeniyle kapillarite kuvvetlere örnek sel. </li><li> 20 ul pipet ile, eklemek yeterli adım 1.2.3 oluşturulan çatlak doldurmak için agaroz montaj eridi. ve her bir meristemi çevreleyen. Agaroz kaldırılan çiçek tomurcuğu (primordium) ve skar seviyesine ulaşmak gerekir. Bu amaca ulaşmak için, bu çatlak her iki ucunda da agaroz eklemek için gerekli olabilir. </li><li> Agaroz ilave edildiğinde, hızla çatlak içine sel olacak; pipet kullanarak, meristem slaytta en yüksek noktası olmasını sağlamak için agaroz montaj erimiş kısmını emmek. Bu görüntüleme sırasında hareket edemez, böylece bu meristemi giderir. </li></ol> 3.. Montaj Kök veya Hipokotil Örnekleri <ol><li> Kökler ve hipokotiller, hiç diseksiyon gereklidir. Hazırlanan cam slayt üzerinde agaroz ince bir film olarak, doğrudan cam üzerinde olan asit ya da bir cam lamel üzerinde ya da bir oluk yapmak. Bu temas halinde olduğu bu sağlanan bir oluk içinde kök veya hipokotil yerleştirinonun bütün uzunluğu boyunca cam. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, numune yüzeyinde kuru olduğundan emin olun. Eğer değilse, hafifçe filtre kağıdı kullanılarak suyun fazlası uzaklaştırıldı. </li><li> 1.2.6 ekleme aşamasında olduğu gibi, numune etrafında monte agaroz eritilir. </li></ol> 4. AFM Hazırlama ve Hassasiyet Kalibrasyon (bir JPK Nanowizard AFM için) <ol><li> AFM üzerinde bir dirsek monte edin. Konsol yuvarlak indenter ile monte edilmelidir. Yarıçapı x, y, z çözünürlük ve hassas ölçüm arşivlenmiş olabilir hangi girinti derinliği belirleyecek. <ol><li> Epidermisteki yüzeyindeki mezo-nano ölçümler almak için, bir 50 nm yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanın; , orta ölçek ölçümleri almak 0.5 mikron yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanmak için; (2-3 hücreleri arasında) mikro ölçümler almak için, 2.5 mikron yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanın. </li></ol></li><li> Konsol ucundaki lazer yerleştirin. Orta lazer hizalamaayna kullanarak captor. </li><li> AFM altında temiz bir bardak yerleştirin. NOT: Aşağıdaki konsol bir deformasyon içine AFM reseptörü üzerindeki lazer pozisyonun sinyalini dönüştürmek için ayarlanır ve bir güç haline çevirmek için, konsolun yay sabiti değerlendirerek edilir. </li><li> 1 V. hedef kuvvet &quot;set point&quot; ile yaklaşım </li><li> &quot;Force spektroskopi&quot; seçeneğini seçin. 2 V maksimal &quot;göreli noktası&quot; ayarlayarak bir girinti yapmak, 40 mikron / sn &quot;hız genişletmek&quot;, ve 5 um için &quot;z uzunluk&quot;. </li><li> &quot;Kalibrasyon Yöneticisi&quot; menüsünden &quot;fit aralığını seçin&quot; düğmesini kullanarak hassasiyeti sığdırmak için öne eğrisinin doğrusal bölümünü seçin. &quot;Göreli set point&quot; &quot;metre&quot; ile &quot;volt&quot; dönüştürülmüş olmalıdır. </li><li> &quot;Kalibrasyon Yöneticisi&quot; menüsünden EL değerlendirmek için &quot;yay sabiti&quot; seçiniztermal dalgalanmalar kullanarak Konsolun asticity. Konsolun spektral yoğunluk arsa almak için Basın &quot;run&quot;. Düşük frekans ile rezonans pik bulun. &quot;Fit aralığını seçin&quot; düğmesini kullanarak takınız. NOT 1:. Termal dalgalanmalar ayarlama hakkında daha fazla bilgi için, Cook ve ark 15 okundu Not 2: (bilinen sertlik ya da malzeme), bir referans konsol ile konsol elastikiyetini değerlendirmek için doğrudan bir yöntemi kullanmak için tercih edilir. Burada kullanılan nazik birini Atef Asnacios 16 tarafından bağışlanmıştır. </li><li> Konsol ucu altında% 10 mannitol çözeltisi 200 ul ekleyin. Ayna kullanarak captor ortasına lazer hizalayın. </li><li> Hassasiyetini yeniden kalibre: &quot;kalibrasyon Yöneticisi&quot; menüsünden, &quot;bilinmeyen&quot; butonuna tıklayın; tekrar 2.5 ile 2.3 adım. </li></ol> . 5 Veri Toplama: Görünen Young Modülü Haritacılık <ol&gt; <li> AFM altına monte edilen örnekleri yerleştirin ve numune üzerine,% 10 mannitol bir solüsyon 500 ul damlacık ekleyin. Mannitol solüsyon birkaç dakika içinde hücreleri plasmolyzes. </li><li> 20 nN hedef kuvveti (&quot;noktasını ayarlamak&quot;) ile yaklaşım (&quot;set point&quot; fazla 3 V olmamalıdır) </li><li> 200 nN bir &quot;göreli set noktası&quot; olan girinti, bir 40 mm / sn &quot;hız uzatmak&quot;, ve 5 mikron &quot;z uzunluğu&quot;. </li><li> Konsol ya da 1 mm / 5 um monte konsol 0.5 um monte nm 200 için 100 nm bir çentik elde etmek üzere &quot;nispi noktası&quot; ayarlayın. </li><li> , Meristemlerde için, bir çözünürlük 64 x 64 (&quot;piksel&quot;) ile 70 mikron x 70 mikron: &quot;force haritalama&quot; modunda taramak için bir bölge seçin hipokotillerinden ve kökleri için, 64 x 64 çözünürlüğe sahip 100 mikron x 100 mm. </li><li> Basın deneyler başlatmak için tarayın. Çıktısını kaydetmek. </li&gt; </ol> . 6. Veri Analizi: Görünen Young Modülü Hesaplamalar <ol><li> Veri analiz yazılımı veri dosyasını açın. </li><li> Tek bir harita tüm eğrileri aynı analizi uygulamak için &quot;toplu işlem&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Böylece girinti derinliği ayıklamak için &quot;konsolun bükme için yüksekliği düzeltmek&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Kuvvet girinti alanı ile orantılıdır üstlenecek &quot;Young modülü uyum fonksiyonunu&quot; seçeneğini seçin. Girinti şekli parabolik olduğunu varsaymak için parabolik &quot;ucu şekli&quot; olarak ayarlayın. </li><li> Uç yarıçapını gösterir. </li><li> O &quot;genişletmek&quot; eğri daha topografya daha az duyarlı olduğu için tercihen analizi için &quot;geri çekme&quot; eğrisi seçin. Prob önemli yapışma sırasında Ancak, eğer &quot;geri çekme,&quot; yapıştırma duyarsız &quot;genişletmek&quot; eğrisi, kullanın. </li><li> Set0,5 Poisson oranıdır. Basın üzerinde analiz ve çıkış kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls.">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li><li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+plant+cell+wall+extension+(creep)+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin.">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).</li><li>Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+(Creep)+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin.">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25 (2009).</li><li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants.">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li><li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense.">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li><li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix:+Insights+for+cell+growth.">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling &amp; behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li><li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TipChip:+a+modular,+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells.">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li><li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xyloglucan+endotransglucosylase/hydrolase+(XTH)+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls.">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li><li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis.">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li><li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants.">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li><li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creep+function+of+a+single+living+cell.">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li><li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants:+the+role+of+pectins+revisited.">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).</li><li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+signaling:+the+new+wave.">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ball+tonometry:+a+rapid,+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells.">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li><li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+or+driving+force?+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth.">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549 (2011).</li><li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling.">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bitkilerde, değişen mekanik özellikler büyüme ve morfolojilerinden yönlendirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Bugüne kadar orada bitki gelişimini kontrol genetik ve kimyasal ağları çözülüyor büyük ilerlemeler kaydedilmiş, ancak bu ağlar katkı ve mekanik özelliklerindeki değişikliklerden nasıl etkilendiğini bilgimiz ilkel gelmiştir. Bu yöntem, bu boşluğu doldurmak için bize imkan vermelidir, ve bu yüzden bitki büyümesi veya morfojenesis&#39;in herhangi bir yönünü inceleyen bilimc...

Bitkilerde büyüme organizmanın her hücre çevreleyen sert hücre duvarlarının koordineli genişlemesi ile elde edilir. Giderek artan kanıtlar bu bitkiler, yerel olarak, bu genişleme kontrol eden hücre duvarı kimyanın tadilatı yoluyla olduğunu gösterir. Genişleme hücrenin yüksek turgor basıncının neden olduğu hücre duvarları, üzerinde yük öncelikle tahrik olması düşünülmektedir; turgor basıncına bu gerginlik tepkisi hücre duvarlarının 1&#39;in mekanik özellikleri tarafından yönetilir. Küçük bu mekanik özellikleri bilinen ve geliştirme sırasında nasıl değiştiğini. Ayrıca biraz bu mekanik özellikleri geribildirimler görünüşte bir doku boyunca koordineli bir şekilde hücre duvarı kimyasını değiştirmeye katkısı olup olmadığını kontrol edilir ve nasıl bilinir. Biz kimyasal ve mekanik gelişimi sırasında bitki hücre duvarlarında değişiklikler ve sonuçta nasıl bu mikroskobik etkileşimlerin bir bitkiyi yöneten arasındaki bağlantıyı anlamak için ise&#39;In makroskopik büyümesi, hücre ya da doku ölçeğinde organları geliştirilmesinde hücre çeperlerinin mekanik özelliklerini izlemek için bir yöntem gereklidir. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi mikrometre veya nanometre doku sıkıştırmasından ya da çentikler dayandığı, burada anlatılan, subselüler çözünürlüklerde aynı anda organları gelişmekte ve doku tüm bölgeler arasında hücre duvarlarının mekanik özelliklerini ölçmek için tam geliştirilmiştir. Diğer yöntemler var ya çok düşük ya da çok yüksek bir çözünürlük: Ekstansometrelerin milimetre ölçeğinde 2-4, erken olayları ölçmek için çok büyük örneğin bir ölçekte tüm doku ortalama mekanik özelliklerini ölçmek için sadece yapabiliyor Organogenezis; microindenter nanometre ölçeğinde hücre içi çözünürlükte ölçümlerini, ancak izole edilmiş hücreler olup hücre ya da organların 5-7 gruplarının ölçümü ile sınırlandırılmıştır. AFM ile, ihtiyaçd doku, hücre ve hücre içi çözünürlükleri 8-10 elde edilebilir. Son zamanlarda çok sayıda protokolleri de 11, 12, kullanılabilecek bitki doku mekanik ölçmek için özel olarak geliştirilmiştir. Biz, belirgin Young modülü 13 ölçü dokuya elastikiyetini değerlendirmek nasıl burada sunacaktır. Young modülü, genellikle bir malzemenin sertliğini tarif etmek için kullanılır. Küçük deformasyon esnasında bir malzemenin deforme edilmesi için gerekli kuvvet girinti alanı ile orantılıdır. Young modülü, bu katsayısıdır. Sürekli bir homojen madde durumunda, aynı katsayısı ne olursa olsun girinti tipi (boyut ve şekil) içinde ölçülür, ancak ölçüm hızı ile değişecektir. Bitki dokusunun bir kompleks yapının durumunda, şimdiye kadar kuvvet belirlenmesini sağlayan bir deformasyon orantılı olduğunu gözlemledikbiz &quot;belirgin genç modülü&quot; adını bir orantılılık katsayısı. Bitkilerde sürekli akışkanda ikinci Bunun aksine, bu bariz genç modülü girinti boyutuna duyarlıdır. Bu saf hücre duvarının genç modülünün karşılık gelmez. Bu, en iyi doku hücre duvarının iskele elastikiyetini açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="850">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard</td>
			<td style="width:167px;">All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM stage</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">CellHesion</td>
			<td>Required for sample withe low topography (les then 11&#181;m between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM optics</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">Top View Optics&#160;</td>
			<td>Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo Microscopes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M125</td>
			<td>Any type of stereo microscopes could do.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">150nm mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">R150-NCL-10</td>
			<td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#181;m mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>SD-Sphere-NCH-S-10&#160;</td>
			<td>to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tipless cantiliver</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>TL-NCH-20&#160;</td>
			<td>to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5&#181;m mounted cantilever. We attached a 5&#181;m borasilicate bead to a tipless cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5&#181;m silicon microspheres</td>
			<td style="width:348px;">Corpuscular</td>
			<td style="width:119px;">C-SIO-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aradilte&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Bartik S.A. 77170 Coubet France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;low melting Agarows</td>
			<td style="width:348px;">Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410</td>
			<td style="width:119px;">BP160-100</td>
			<td>34-45 Gelation Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-Mannitol</td>
			<td style="width:348px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)</td>
			<td style="width:119px;">M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2&#160; Stainless Steel No. 5 Tweezers</td>
			<td style="width:348px;">Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland&#160;</td>
			<td align="right">951199</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

Biz bir JPK AFM için, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) mikro / nano-çentikler kullanılarak bitki dokularının yüzeylerinin mekanik özelliklerini ölçmek için yeni geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, bu protokolde, çiçek meristemler, hipokotiller, ve köklerde x 100 um kadar 100 um&#39;lik bölgeler arasında hücre içi çözünürlüklerde hücre duvarlarının belirgin Young modülüne ölçün. Bu numunenin dikkatli hazırlanması, mikro-indenters ve girinti derinliklerinde doğru seçimi gerektirir. Sadece, ölçümler hücreleri plazmolize ve böylece hücre turgor basınç katkı çıkarmak için manitol yüksek ölçüde konsantre çözeltiler içinde gerçekleştirilen hücre duvarı özellikleri hesaba katılması için. Diğer kaybolmamış tekniklerin aksine, farklı çentikleri ve girinti derinliği kullanılarak, bu yöntem, aynı anda çok ölçekli ölçümleri sağlar: <em&gt; Subsellüler çözünürlüklerde ve bir doku içeren hücrelerin genelinde yüzlerce yani. Bu, uzaysal-temporal tarzda büyümesi ve farklılaşması ile ilişkili olduğu için bu değişiklikleri sağlayan, geliştirme sırasında hücre çeperlerinin mekanik özelliklerinde yer alan karakterize etmek artık mümkün olduğu anlamına gelir. Bu koordineli mikroskobik hücresel değişiklikler makroskobik morfojenetik olaylar hakkında getirmek nasıl anlamak için önemli bir adımı temsil etmektedir. Ancak, bazı sınırlamalar kalır: bu yöntem sadece (100 çapı um civarında) ve bu dış dokularda oldukça küçük numuneler üzerinde kullanılabilir; yöntem, doku topografya duyarlıdır; bu dokusunun karmaşık mekanik özelliklerinin sadece bazı yönlerini ölçer. Teknik hızla geliştirilmektedir ve bu sınırlamalar çoğu yakın gelecekte çözüleceğini olasıdır.

Şekil 1 de çiçek Meristemlere tipik Genç modülleri haritalar (Şekil 1A ve 1B), genç ve yaşlı hipokotilleri (Şekil 1C-F) ve kök meristem (Şekil 1G ve 1H) sunuyoruz. Tüm deneylerde delici yarı-küresel, ancak farklı uzamsal çözünürlük elde edilebilir, böylece bunun radius farklıdır 1C ve 1D meso-nano girinti (50 nm derinlik) meso-nano indenters (50 nm çapında) iç...

Watch this Scientific Journal Video about AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions at JoVE.com

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Görüntüleme.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Video: AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biyoloji

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic properties. Density is a cell type identifying property, directly related to its metabolic rate, differentiation, and activation status. Magnetic levitation allows a one-step approach to successfully separate, image and characterize circulating blood cells, and to detect anemia, sickle cell disease, and circulating tumor cells based on density and magnetic properties. This approach is also amenable to detecting soluble antigens present in a solution by using sets of low- and high-density beads coated with capture and detection antibodies, respectively. If the antigen is present in solution, it will bridge the two sets&#160;of beads, generating a new bead-bead complex, which will levitate in between the rows of antibody-coated beads. Increased concentration of the target antigen in solution will generate a larger number of bead-bead complexes when compared to lower concentrations of antigen, thus allowing for quantitative measurements of the target antigen. Magnetic levitation is advantageous to other methods due to its decreased sample preparation time and lack of dependance on classical readout methods. The image generated is easily captured and analyzed using a standard microscope or mobile device, such as a smartphone or a tablet.

This paper describes a magnetic levitation-based method that can specifically detect the presence of antigens, either soluble or membrane-bound, by quantifying changes in the levitation height of capture beads with fixed densities.

Manyetik Levitasyon Kullanılarak Hücresel Yoğunlukların ve Antijenik Özelliklerin Nicelleştirilmesi

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...