Tek bir kalıntı ikamesinin zorluğu, tek kalıntıdaki farklılığa rağmen hayvanları verimli bir şekilde genotiplemektir. Bir kısıtlama enziminin özel kullanımı, tipik PCR tabanlı genotiplemeye sadece tek, hızlı ve düşük maliyetli bir adım ekler. Bu protokol, hedef dizi genellikle böyle olan bir kısıtlama enzimi tarafından tanınırsa, mutasyon noktasına sahip başka herhangi bir fare modeline uygulanabilir.
Kuyruk ucunun bir ila üç milimetresini temiz makasla kesin ve 0,2 mililitrelik sekiz şeritli PCR tüpüne aktarın. Kuyruk örneğini el yazmasında açıklandığı gibi içerdikten sonra, ekstraksiyona kadar, yaklaşık bir haftaya kadar T-eksi 20 santigrat derecede saklayın. Tüp başına 100 mikrolitre doku lizis çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.200 kez G'de bir masa üstü minisantrifüj kullanarak spin-down yapın.
Kuyruk numunelerinin çözeltiye batırıldığından emin olun. Tüpleri, doku lizisi, inaktivasyon ve tutma parametrelerini programlayarak bir termal döngü setine ayarlayın. PCR hemen yapılamazsa doku lizatını dört santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın.
Beş mikrolitre nükleaz içermeyen su, 0.75 mikrolitre 10 mikromolar ileri ve geri primerler ve numune başına 7.5 mikrolitre PCR ana karışımı içeren bir PCR çözeltisini yeni bir PCR tüpüne hazırlayın. Önceden hazırlanmış doku lizatının bir mikrolitresini PCR çözeltisine ekleyin. PCR solüsyonunu iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.200 kez G'de bir masa üstü minisantrifüj ile aşağı doğru döndürün.
Tüpleri programlanmış bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerini bir ila iki ay boyunca dört santigrat derecede veya eksi 20 santigrat derecede yaklaşık bir yıl saklayın. Yedi mikrolitre nükleaz içermeyen su, 10X gücünde iki mikrolitre CutSmart tamponu ve bir mikrolitre NlaIII kısıtlama enzimi içeren enzim çözeltisini hazırlayın.
Birkaç örnek varsa, karışımı yapmak için her içeriği çarpın ve tüp başına 10 mikrolitre aliquot yapın. Daha önce elde edilen 10 mikrolitre PCR ürününü tüp başına enzim çözeltisine ekleyin. İyice karıştırın ve daha önce gösterildiği gibi masa üstü minisantrifüj ile aşağı doğru döndürün.
Tüpleri programlanmış bir termal döngü veya ısı bloğu üzerine ayarlayın. Ürünü inkübasyondan sonra soğuk koşullarda saklayın. 50 mililitre tek mukavemetli TAE tamponuna 0.75 gram agaroz ekleyin.
Agarozu mikrodalgada tamamen çözünene kadar karıştırın ve ısıtın. Soğuduktan sonra, beş mikrolitre DNA lekesi ekleyin ve yavaşça karıştırın. Agaroz jelinin 25 mililitresini jel kalıbına dökün ve jelin katılaşmasını bekleyin.
Kuyuya 10 mikrolitre sindirilmiş PCR ürünü yükleyin. Jeli 35 dakika boyunca 100 volt ile çalıştırın. Agaroz jelini ultraviyole ışık altında görüntüleyin.
Sindirilmiş PCR ürünü kullanılarak gerçekleştirilen agaroz elektroforezi, sırasıyla vahşi tipte iki, heterozigotta üç ve homozigotta bir bant ile her genotipte farklı boyutlarda birkaç bant ile sonuçlandı. Blastosist analizi ile test enjeksiyonu, donör oligoların mikrolitresi başına 50 nanogram enjekte edilmesinde% 76.9'luk bir başarı oranı ve aynı donör oligoların mikrolitresi başına 25 nanogram enjekte edilmesinde% 25'lik bir başarı oranı ile sonuçlandı. Son olarak, donör oligoların mikrolitresi başına 50 nanogramın etanol çökeltilmesi ile enjekte edilmesi, kurucu hayvanların% 50'lik bir başarı oranına sahip olmasını sağlamıştır.
Oligo donörlerinin etanol çökeltme ile saflaştırılması, yüksek genom düzenleme verimliliğini korurken toksisiteyi azaltmıştır. Dikkatli kullanım ve düşük miktarda reaktif eklenmesi çok önemlidir. Doğru şekilde eklendiğinden ve iyice karıştırıldığından emin olun.
