Bu protokol, Caenorhabditis nematodlarının doğadan izolasyonunu ve tanımlanmasını kolaylaştırmak ve nematodların doğal ortamıyla ilişkili önemli ekolojik ve çevresel verileri kaydetmek için kullanılabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, mobil veri toplama platformlarından, bulut tabanlı veritabanlarından ve standartlaştırılmış veri işleme işlevlerinden yararlanarak mümkün olan ölçeklenebilirliği ve doğruluğudur. Başlamak için, Caenorhabditis nematodlarını araştırmak için bir yer belirleyin.
Bir Fulcrum projesi oluşturmak için, ücretsiz bir eğitim sözleşmesi kullanarak çevrimiçi olarak Fulcrum ile bir hesap oluşturun ve nematod alan örnekleme uygulamasını ekleyin. Ardından nematod izolasyon uygulamasını ekleyin. Koleksiyonları izlemek için bir dizi QR kodu etiketini C-Etiketleri ve nematod yalıtımlarını izlemek için S-Etiketleri olarak yazdırın.
C-Etiketlerini paketleme için Ziploc plastik torbalara takın. S-Label setini laboratuvarda kullanılmak üzere saklayın. Fulcrum mobil uygulamasının açılır menüsünden nematod alan örneklemesini seçin ve projede yeni bir kayıt başlatmak için artı tuşuna basın.
Alt tabakanın fotoğrafını çekin. C-Label alanına dokunun ve taramayı seçin. Mobil cihaz kamerasını kullanarak toplama çantasındaki barkodu tarayın ve ardından bitti'ye dokunun.
Alt tabaka alanına dokunun ve bir alt tabaka türü seçin. Temassız termometreyi kullanarak substratın yüzey sıcaklığını ölçün ve substrat sıcaklık alanındaki değeri kaydedin. Ayrıca ortam sıcaklığını ve nemi ölçün ve kaydedin.
Ekranın sol üst köşesindeki kaydet'e dokunarak Dayanak Noktası'nda kaydedin ve kaydedin. Substratı almak için toplama torbasını eldiven olarak ters çevirerek çubuklar veya diğer sert parçalar olmadan substrattan bir çorba kaşığı toplayın, ardından torbayı kapatın. Her Ziploc torba için, torbanın üzerindeki C-Etiketini not edin ve OP50 bakterileriyle lekelenmiş 10 santimetrelik bir plakanın kapağına eşleşen bir C-Etiketi takın.
Her toplama torbasından bir çorba kaşığı numuneyi temiz bir plastik kaşık kullanarak C plakalarına aktarın. Dayanak noktası uygulamasında, uygulama menüsünden nematod yalıtımını seçin. Ardından sağ alttaki artı simgesine dokunarak yeni bir yalıtım kaydı yapın.
Bir numuneyle ilişkilendirilmiş C-Etiketini bulmak için seç düğmesine dokunun. Arama simgesine dokunun. Ardından C-Label QR kodunu taramak için tarama simgesine dokunun.
Diseksiyon mikroskobu ile C plakasında nematodları arayın. Numune üzerindeki nematodların varlığını kaydetmek için numune alanındaki solucanlara dokunun. Nematodlar yoksa, C plakasını parafilm haline getirin ve biyolojik tehlike kutusuna atın.
Nematodlar varsa, C plakasından beş adede kadar nematodu izole edin ve her birini kendi S plakasına aktarın. Ardından, bu yalıtım için kullanılan S plakasını girmek için S etiketli plakalar alanına dokunun. Sağ alttaki artıya dokunun.
S-Label'a dokunun ve ardından cihaz kamerasını açmak için taramaya tıklayın, ardından S-plakasındaki S-Label QR kodunu tarayın. İzolasyon kaydında tüm bilgiler doğru bir şekilde eklendikten sonra sağ üstteki kaydet düğmesine dokunun, ardından izole nematodlarla S plakalarını parafilme alın ve bunları nematodlarla S plakalarını tutmak için belirlenmiş bir alana koyun. Fulcrum web sitesinde oturum açın ve nematod izolasyon uygulamasını seçin.
Nematod izolasyon s_labeled_plates içeren bir zip dosyasını indirmek için dışa aktarıcıya tıklayın. csv dosyası. Vahşi soylu genotipleme şablonu Google E-Tablosu'na gidin ve Google E-Tablosu'nu kopyalayın.
Nematod izolasyonundan kopyalanan S-Label'ları s_labeled_plates yerleştirin. csv sütunu genotipleme sayfasına yerleştirin. İzolasyondan 48 saat sonra S plakalarında çoğalan hayvanları kontrol edin.
Bir S-plakasında çoğalan hayvanlar varsa, genotipleme sayfasındaki proliferasyon 48 sütununa bir tane girin, ardından S-plakasını 48 saat proliferasyon kutusu one etiketli bir kutuya taşıyın. İzolasyondan 48 saat sonra çoğalmayan S plakalarını, izolasyondan sonraki 168 saatte tekrar kontrol edin. Bir S-plakası şimdi çoğalıyorsa, genotipleme sayfasındaki proliferasyon 168 sütununa bir tane girin ve ardından S-plakasını 168 saat proliferasyon kutusu one etiketli bir kutuya taşıyın.
Google E-Tablo'daki genotipi, lize edilecek bir çoğalma kutusuna yalnızca S-Etiketlerini içerecek şekilde filtreleyin, ardından lizis düğümleri aracılığıyla S-Label sütunlarını seçin. Lize edilecek her çoğalma kutusu için bir lizis çalışma sayfası yazdırın. Lize edilecek numuneler için 12 kuyucuklu şerit tüp hazırlayın.
Bir şerit tüpün kapağını açın ve tekrarlanan bir pipetleyici ile her kapağa sekiz mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Kaynak plakalardan üç ila beş hayvanı lizis çalışma sayfasında belirtilen kapak konumlarına seçin. Sekiz adede kadar şerit tüp için tekrarlayın ve şerit tüpleri eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirin.
Şerit tüp setlerini çıkarın ve termosiklustaki lizis programını çalıştırın. Daha sonra lizatları eksi 80 santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın. Şerit tüpleri eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve lizis malzemesini buz üzerinde çözün.
Lizis malzemesi çözülürken, ITS2 ve SSU master karışımlarını buz üzerinde ayrı tüplerde hazırlayın. Düşük hacimli çok kanallı pipetle PCR plakasındaki uygun kuyucuğa iki mikrolitre lizat ekleyin. PCR'leri uygun termosikler programı ile çalıştırın ve genotipleme sayfasına hangi S-Label'ların ITS2 veya SSU PCR ürünleri verdiğini kaydedin.
ITS2 pozitif olan her örnek için, Sanger dizilimi için kalan ITS2 PCR ürününü kullanın ve sıralama platformundan her S-Label için seq çıktı dosyalarını alın. BLAST aramasını başlatmak için bir web tarayıcısında NBCI BLAST web sitesine gidin. Bir Caenorhabditis türüne TAŞAN S plakası dizileri için, tür kimliği sütununa en üstteki BLAST isabetinin tam cinsini ve tür adını girin.
Caenorhabditis terminolojisi kurallarını izleyerek suşları benzersiz adlarla adlandırın ve suş adı sütununa gerinim adlarını girin. Verileri işlemek için Fulcrum web sitesine gidin ve ham proje verilerini Fulcrum veritabanından dışa aktarın. Yeni bir R komut dosyası açın ve toplama verilerini işlemek için easyfulcrum vinyetindeki yönergeleri izleyin.
NBCI BLAST'ta, S-Label S-05554 için elde edilen sonuçlar, en çok isabet alan kişinin Caenorhabditis briggsae olduğunu gösteriyor. Ek olarak, bazı izole nematodlar genotip için ek çaba gerektirir. Örneğin, izolatların yaklaşık% 2'si ilk lizis girişiminden sonra SSU PCR astar seti ile amplifikasyonda başarısız olur ve lizis malzemesinin ITS2 astar seti ile amplifikasyon için uygun olduğundan emin olmak için güvenilmelidir.
Bu prosedürü takiben, araştırmacılar, belirli nematod türlerini barındırma olasılığı en yüksek olan yerleri ve substrat özelliklerini belirlemek için vahşi nematod izolatlarıyla ilişkili ekolojik ve çevresel verileri keşfedebilirler.
