Yazarlar kullanılan bu protokol ve araçları geliştirme katkıları için Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Şeker, Eric Stabb, ve Todd Ciche teşekkür etmek istiyorum. KEM ve JMC Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü T32 (AI55397 &quot;Sağlık ve Hastalık mikrop&quot;) tarafından desteklenmiştir. JMC Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Lisansüstü Araştırma Bursu ile desteklenmiştir. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (IOS-0920631 ve IOS-0950873) hibe tarafından desteklenmiştir.

1. Konjugasyon üzeri Floresan Bakteriyel Gerinim İnşaat <ol><li> Alıcı suşu (symbiont irdelenmesine) ve donör zorlanma gecede büyümek. Verici gerilme, genellikle Escherichia coli, birleşme yoluyla DNA verici yeteneğine sahip olmalıdır ve transforme edilmesi gereken bir floresan proteini kodlayan bir gen taşır, (Tablo 2) plazmid. Plazmid bağlı olarak, bir birleşme yardımcı yük de gerekli olabilir. Eğer öyleyse, bu gerginlik de gecede yetiştirilmelidir. Donör strain ve strain yardımcı plazmid bakımı için seçmek için antibiyotik ile yetiştirilmelidir. </li><li> Orta kültür 1:100 oranında antibiyotik eksik besin açısından zengin büyüme ortamı içine donör, yardımcı ve alıcı suşlar altkültür. </li><li> Onlar orta-log aşamalı büyüme (OD 600 ~ 0.6) ulaşana kadar her bir suş için uygun sıcaklıkta kültürleri büyütün. Xenorhabdus ve E. için Bu aşamada büyümek coliTh alt kültür sonra yaklaşık olarak 3-4 saat ulaşılır. Bu gerilme bağlı olarak değişebilir, veya bazı durumlarda da plazmid, kullanılmış olabilir. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp ve 17,900 xg (çoğu mikrofüjler 13.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüj suşları karıştırın. En iyi sonuçlar verir donör ve alıcı oranı farklı kombinasyonlar için değişir ve ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir. Bir Xenorhabdus alıcı ve E. için coli donör, bir 3:1 veya 1:1 oranında kullanın. Bir yardımcı suşu (örneğin, E. coli) gerekli ise, bu verici olarak aynı oranda ilave edilmelidir. </li><li> Süpernatant süzün. </li><li> Taze medya 30 ul hücre pelletini yeniden askıya. </li><li> Herhangi bir antibiyotik olmadan bir besin zengin medya plaka üzerine süspansiyon Nokta ve spot kurumasını bekleyin. </li><li> Donör için alıcı bakteriye ve izin verilen (ve yardımcısı varsa) için optimal bir sıcaklıkta gecede ters plaka, inkübe edin. Plakası olmalıdırEn az 18 saat inkübe edilebilir. </li><li> Bir seçici antibiyotik yüzeyindeki tek koloninin için spot ve çizgi kadar kazıyın. Antibiyotikler donör karşı ve plazmid içeren alıcı için seçmelisiniz. Bir ya da iki ilave izolasyon çizgiler saf bir kültür izole etmek için gerekli olabilir. </li><li> Çıkan koloniler gibi koloni morfolojisi, veya alıcı-spesifik genlerin polimeraz zincir reaksiyonu tespiti gibi alıcının belirli fenotipler, varlığı için tarama tarafından alıcıya symbiont değil, donör zorlanma, emin olun. Bilinen bir dizi plasmid ve floresan polimeraz zincir reaksiyonu plazmid varlığı için koloniler ekran. Koloniler floresan protein karşılık gelen doğru dalga boyu altında flüorışı gerekmektedir. </li></ol> 2. Axenic Nematod Yumurta üretimi <ol><li> Gece boyunca, doğal bakteri symbiont 5 ml büyütün. Bir kültürü başlatmak için, bakteri Lysogeny Broth (LB) veya diğer cu inoküle edilebilirdoğrudan bir dondurucu stok ya da bir çizgi plaka LTURE medya. </li><li> 10 mm Lipid Agar (LA) plakaları 29 üzerine bakteriyel kültürün 600 ul yayın. Sekiz-on tabak türlerin çoğu için yeterli nematodlar verecektir. </li><li> Iki gün boyunca 25 ° C&#39;de nem olmadan karanlıkta inkübe edin. </li><li> Bakteriyel çimler için medya 500 ul, kullanılan nematod bağlı 5.000 infektif juvenil nematodlar, diğer kademelere veya ekleyin. 3 gün için 25 ° C sıcaklıkta inkübe plakaları. </li><li> Erişkin nematodlar ve yumurta varlığı için plakaları kontrol edin. Bir mikroskop lamı üzerine su 20 ul yerleştirin. Bakteriyel çim kazıma-up küçük bir miktar nematodların steril bir sopa kullanma. Suya sopa yerleştirin ve nematod yüzmek kapalı izin verir. Düşük büyütme altında slayt bak. Görünümü hakkında daha fazla bilgi için tartışma ve Şekil 2&#39;ye bakınız. </li><li> Yumurta ve kadınlarda görülebilir durumdaysa, devam, aksi halde 25 &amp; d plakalar inkübeörneğin; düzgün gelişimi her 6-12 saat için C ve kontrol edin. Dişiler yumurta içeren olduğunda, plakaların yüzeyinde su birkaç ml yerleştirin. Yavaşça girdap plakaları ve 50 ml konik tüp içine su dökün. Nematodlar plakaların dökülmek ve artık plaka yüzey üzerinde görünür olması gerekir. Çeşitli durulama gerekli olabilir. </li><li> Nematodlar tüpün dibine yerleşmek için izin verin. </li><li> Nematodlar durulayın. Tüpün üst dan fazla su pipet. Temiz su ve yetişkin nematod yerleşmek için izin ile doldurun. Fazla su pipet. </li><li> Yumurta çözeltisi ile konik boru doldurun. Yumurta solüsyonu eklendikten sonra yumurta çözümü ile tüm adımların zamanlaması tam olarak maksimum yumurta verimi için anlatılan işlemleri yapmalıdır. Nazikçe tam 10 dakika boyunca çalkalanırken inkübe edin. Çoğu nematod inkübasyon sonuna kadar çözülmüş olmalıdır. </li><li> Hemen (bu hız santrifüj getirerek içerir tam 10 dk 1250 xg&#39;de konik tüpler santrifüjama aşağı 0 x g. ) Frenini kullanın. </li><li> Hemen süpernatant süzün. </li><li> Hemen pipetleme yumurta çözüm pelet yeniden askıya. </li><li> Hemen yumurta solüsyonu ile konik tüp doldurun ve tersini 3-5 kat iyice karıştırın. Sonra hemen 2.10 olarak dönerler. </li><li> Hemen süpernatant süzün. </li><li> Pipetleme LB pelet yeniden askıya, yıkama adımları sırasında geliştirilmiş peletleme için bir 15 ml konik tüp aktarabilirsiniz. LB Steinernema spp için standarttır. Diğer tamponlar (minimal tuzlar ortamı gibi) tampon nematod veya bakteri ya da zarar vermemelisin akılda tutarak, nematod ve bakteri bağlı olarak kullanılabilir. </li><li> 2.10 gibi LB ve spin ile tüp doldurun. </li><li> Süpernatant Durusu ve LB yeniden askıya. </li><li> 2.14 ve 2.15 tekrarlayarak nematodların 3 kez toplam durulayın. </li><li> Uygun bir birime yeniden askıya nematod yumurtası seyreltin. Mikrolitre başına en az 10 yumurta olmalıdır. Örnekgs kolonize olan bakterilerin gelişimini inhibe antibiyotik ekleme ve parafilm içinde plaka sarma göre en az dört gün için 5 ml LB içinde bir 6-santimetrelik bir petri tabağına saklanabilir. Yumurtalar önce bakteriyel çimler üzerine inokülasyon için bir kez 15 ml LB (2.13 ve 2.14 gibi) yıkanmış gerekecektir. Yumurta bu dönemde yumurtadan olacaktır ve kolonizasyon deneylerde kullanıldığı zaman gelişimsel senkronize olmayabilir unutmayın. </li></ol> 3. Floresan Bakteriler ile Co-ekimi Assay <ol><li> Gerekirse plazmid için seçerek, gecede floresan bakteriler büyümek. </li><li> Steril bir çubuk ile 10 mm Lipid Agar plaklarına bakteriyel kültürün 600 ul yayın. 2 gün boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her lipit agar plaka üzerine 100 ila 400 ul (200 ul optimum 2.000 nematod) toplam yerleştirin 500-5,000 axenic nematod yumurtası. </li><li> 25 nem olmadan karanlıkta inkübe ° C IJs, veya ilgi, formun diğer evrelere kadar. IJs bir fu gibi görünür olacakplakasının kenar üzerinde zzy beyaz bir halka. Diğer yaşam evreleri bakmak için, Protokol 4&#39;e bakın. </li><li> Modifiye edilmiş bir beyaz tuzak 30 plakaları yerleştirin. Lipid agar plaka kapağını çıkarın ve boş bir 100 mm x 20 mm Petri kabı dibine alt yerleştirin. Küçük tabak surround, su ile büyük bir Petri kabı veya nematod uygun diğer tampon doldurun. Su seviyesi küçük plaka yaklaşık olarak yarısı yükseklikte olmalıdır. </li><li> Döl IJs tampona ortaya kadar su tutucu inkübe edin. </li><li> Enfektif çocuk nematodlar bir doku kültürü şişesi içinde su içinde muhafaza edilebilir. </li></ol> 4. Tarama için Erken Yaşam Evreleri Koleksiyonu <ol><li> Kullanım tahlil kurmak için 3.4 ile 3.1 adım. </li><li> İstediğiniz yaşam evrelerinde mevcut olana plakalar inkübe edin. Günlük görsel kontrol zamanını belirlemek için gerekli olabilir. Plakaları denetlemeyi için, Protokol 2,5 açıklanan yordamı kullanın. S. için carpocapsae </eX ile m&gt; eggsgrown LA plakaları üzerinde nematophila, gebe kadınlarda 4-5 gün mevcut olacak, gençlerin 7 gün mevcut olacak ve infektif juvenil 15-17 gün üretilmeye başlayacaktır. </li><li> İstediğiniz yaşam evrelerinde mevcut olduğunda, örnek toplamak. 200 ul PBS ya da diğer uygun bir tampon ile bir 96 kuyulu plakanın bir kuyu doldurun. Yavaşça nematodlar içeren bakteriyel çim bazı kazıyın. Bezelye büyüklüğünde bir miktarda (~ 50 mg) F1 soyu üretilir kez, en azından birkaç yüz nematod sağlayacaktır, fakat daha erken zaman noktası için gerekli olabilir. De içeren tampon içine sopa yerleştirin. </li><li> Bir dakika 30 saniye süreyle inkübe edin. Sopa çıkarın ve kalan kalıntı kazıyın. De herhangi bir agar kaldırmak için sopa kullanın. Nematodlar tampon içinde görünür olmalıdır. Temiz bir mikrofuge&#39;de tüp tampon karışımı taşıyın. </li><li> Levamizol veya diğer felç ajan ile nematodlar davranın. 30 &amp; Mu içine levamizol birkaç tane eritin, Su l. Örneğin her 50 ul için bu karışımı 1-2 ul ekleyin. Levamizol Tedaviden sonra nematodların cansız olacaktır. </li><li> Örnekler daha sonraki bir tarihte izlendi edilecek ise bu adımda açıklandığı gibi, düzeltin. Değilse, 4.6 adıma atlayın. 1X tampon ve% 4 paraformaldehid içeren fiksatif solüsyonu 200 ul ekleyin. İyice karıştırın, pipetleme hassas yaşam evreleri lyse neden olabilir. Folyo ile kaplayın, ve en azından 18 saat boyunca düşük bir karıştırma cihazı üzerinde, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Bir raf tüp içinde tüp yerleştirin ve nematodların tüpün altına yerleştirmek için izin verir. </li><li> Arka planı kaldırmak için nematodlar durulayın. Aşırı sıvı kapalı pipet ve 200 eklemek - tampon 500 ul ve hafifçe karıştırın. Tekrarlayın. Bu istenirse bir kaç kat daha fazla arka planı kaldırmak için tekrar edilebilir. </li><li> Nematodlar tüpün dibine yerleşmeye ve istenilen hacimde yeniden askıya izin verin. </li><li> Hemen nematodlar sabit değilse, ekran. Sabit nematodlar kadar buzdolabında saklanabiliriki hafta. Karanlıkta saklayın. </li></ol> 5. Mikroskopi Bakteriyel Derneği Tarama Nematodlar <ol><li> Sizin karışımı küçük bir örnek çıkarılarak mikroskop altında görüntülemek için bazı nematod seçin. </li><li> Nematodlar resim için hala emin olmak için, Protokol 4.5 açıklandığı gibi bir paralitik ajan ile tedavi. Bir resim almayan veya nematod zaten sabit ise, bu adım atlanabilir. </li><li> Mikroskop slayt su kurtları 20-30 ul ekleyin ve üstüne bir lamel yerleştirin. </li><li> Nematodlar görüş alanında olmasını sağlamak için ışık mikroskobu kullanılarak, tam nematodlar görüntüle. </li><li> Bakteriler tarafından ifade floresan karşılık mikroskop floresan ayarını kullanarak nematodlar görüntüle. </li><li> Bakteriyel lokalizasyonu belirlemek için, floresan ayarı ve ışık mikroskobu ayarı altında nematod fotoğraf çekmek ve daha sonra görüntüler üst üste. Fotoğraflar aynı fiel olmaları gerekirgörünümü d. Bu bakteriler için nematod çeşitli büyütme ve izleme denemek için gerekli olabilir. </li><li> Nematod kolonizasyon dağılımı bakterilerin varlığı veya yokluğu için puanlama ve yüzde kolonize hesaplanırken, nematod nüfus sayımı ile belirlenebilir. Biz nüfus içinde en az 30 nematod güvenilir bir değer elde etmek için (kolonizasyonu olan veya olmayan) her kategoride sayılır kadar sayma öneririz. </li><li> Nüfus içinde sadece birkaç nematodlar kolonize olan zaman, yaklaşık 30 önce birkaç bin nematod saymak için gerekli görülmektedir olabilir. High-throughput sayma için aşağıdaki adımları kullanın. </li><li> Bir çok-plaka içine ayrı ayrı yerine nematod sayma, kısım nüfus (24 plaka gibi). Nematodlar çanak dibine yerleşti sonra, her bir kuyunun mikroskop taranabilir ve kolonize nematod sayısını attı edilebilir. </li><li> Nematod sayısı ina nüfus içinde oldukça nematodların seri seyreltmeler ile tespit edilebilir. Örneğin, nematodlar, 1 ml ilave edilebilir bir de, iyi bir pipet ucu ve 3 ul ile karıştırılarak karışık çıkarıldı ve iyi toplam ölçümü için nüfus sayılabilir. </li><li> Kolonize nematod yüzdesi olarak da nematod toplam sayısı tarafından kolonize sayısına bölünmesi ile elde edilebilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Xenorhabdus bakteriler ile ilişkili Steinernema nematod örnekleri mikroskop Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Şekil 3A görülen kompozit görüntüyü oluşturmak için, bir faz kontrast görüntü floresan görüntü ile üst üste oldu. Şekil 3A &#39;daki ok bakterilerin enfeksiyon yapıcı çocuk nematodu (bar = 100 um) içinde mevcut olduğunu gösterir. Şekil 3B, benzer bir şekilde yapılmış ve bir çocuk nematod wi tasvir edilmiştirinci yeşil floresan protein etiketli bakteri (yeşil çubuklar) nematod bağırsak lümeninde (bar = 20 mikron) çapında lokalize. İki medya nematod nüfusu bakteriyel symbiont (Tablo 1) tarafından sayılır ve kolonizasyonu için skorlandı. Sağlam istatistikler için, en az 30 her kategoride düşen numune başına en az 100 nematod saymak için en iyisidir. Tablo 1&#39;de görüldüğü gibi karaciğer, böbrek agar üzerinde büyüdüğü zaman lipit agar ve% 68,6 üzerinde büyüdüğü zaman, bu nematodlar yaklaşık% 14,6 düzeyinde kolonize edilmiştir. Diğer nematod ve bakteri türlerinin kolonizasyon farklı düzeylerde olduğu gösterilmiştir. Örneğin X. için nematophila S.% 99 kolonize carpocapsae infektif juvenil (Martens 2003) ve P. luminescens H. 26% kolonize bacteriophora infektif juvenil (Ciche 2003). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4298/4298fig1.jpg" /> Şekil 1. Yöntemin şematik. A. bir bakteri, floresan proteinini ifade tasarlanmıştır. B. Nematod yumurtaları steril nematod üretmek için yetişkin nematod izole edilmiştir. C. Steril nematodlar floresan bakteri ile birlikte yetiştirilmektedir. D. nedeniyle yaşam aşamaları altında görüntülenebilir mikroskop nematod içinde bakteriyel varlığının araştırılması. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4298/4298fig2.jpg" /> Şekil 2. Yumurta içeren yetişkin kadın tasviri. A. şematik Steinernema kadınların genel görünümünü gösterir. Ankastre: Bir S. DIC görüntüsü feltiae kadın gravid. Siyah ok vulva gösterir. Beyaz oklar görünür yumurta göstermektedir. Görüntü 20X büyütme ve ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. Gelişmiş ama çıkmamış S. B. DIC görüntüsünematod yumurta feltiae. Görüntü 40X büyütme ve ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. Yumurtaların C. DIC görüntü izole S. gelen 10X büyütme altında nematodlar feltiae. Ölçek çubuğu 100 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4298/4298fig3.jpg" /> Nematod-bakteriyel dernek Şekil 3. Örnek mikroskop görüntüleri. A. S. puntauvense nematodlar onların bakteriyel symbiont, X ile ilişkili bulunmuştur bovienii, ifade GFP. Görüntünüzün aynı alanda bir floresan görüntü ile bir faz kontrast görüntü overlaying tarafından üretilen bir kompozit görüntü. Ok nematod konak içindeki floresan bakteriyel symbiont gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. B. Bu görüntü S. gösterir GFP ifade X&#39;de carpocapsae juvenil nematod nematophila nematod bağırsak yerleşmiştir.Bu görüntü bir diferansiyel girişim kontrast görüntünün üzerinde floresan görüntü overlaying yoluyla inşa edilmiştir. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder. <table border="1"><tbody><tr><td> Zorlanma </td><td> Acteria ile Nematodlar sayısı </td><td> Toplam Nematodlar Sayılan </td><td> Nematodlar Yüzde olonized </td></tr><tr><td> S. puntauvense Lipid Agar </td><td> 30 </td><td> 205 </td><td> 14.60% </td></tr><tr><td> S. puntauvense Karaciğer Böbrek Agar </td><td> 72 </td><td> 105 </td><td> 68.60% </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Bakteriyel varlığı için bir nematod popülasyonu örneği puanlama. Bu deneyde, axenic S. puntauvense nematodlar kolonizasyon kusurları sınamak için farklı büyüme ortamı üzerindeki GFP ifade symbiont (lipid agar ve karaciğer, böbrek agar 32) ile yetiştirilmiştir. En az bir hundre toplamnumune başına d nematod bakterilerin varlığı için sayılır ve skorlandı. Istatistiksel güç için, üç deney her kategoride düşen en az 30 nematodlar ile sayılmalıdır çoğaltır. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/4298/4298table2.jpg" /> Tablo 2. Fluoresan proteini içeren plazmid. Bakteri symbiont içine bir floresan protein yerleştirilmesi için potansiyel plazmid plazmid bir listesi adı göre listelenir verilir. Dahil Diğer bilgiler plazmid bakım için kullanılan floresan protein kodlanmış, antibiyotik kaset, kullanmak için başka yönergeler, plazmid kaynağıdır. Parantez içinde not konsantrasyon X için kullanılan antibiyotik konsantrasyonu nematophila. Bu plazmidler her Xenorhabdus veya Photorhabdus da başarıyla kullanılmaktadır. Ek bilgiler belirtildiği atıf elde edilebilir. Bağlıtest edilen bakteri, bazı plazmid floresan protein, antibiyotik seçimi, insersiyon veya çoğaltma kökeni dayalı çalışmayabilir. Yukarıda belirtilen plazmid ilgi bakteri kullanımı mümkün kılabilir farklı özellikleri içerir. Örneğin, kromozom attTn7 sitesi içine mini Tn7-KSGFP uçlar ise X içine pECM20 ekler homolog rekombinasyon ile nematophila kromozom. Alternatif olarak, plazmidler pPROBE extrachromosomally korunur ve her bir plazmid pPROBE aynı omurga ve florofor sahiptir, ancak taksonomik ya da mutant arka çeşitli kullanımlarını sağlamak için farklı seçilebilir marker ya da replikasyon kökeni sahiptir.

<ol>
	<li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades.">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li><li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype.">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li><li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+(Achromobacteraceae:+Eubacteriales)+in+the+development+of+the+nematode,+DD-136+(Neoaplectana+sp.+Steinernematidae).">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).</li><li>Bird, A. F., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+the+intestinal+vesicle+in+nematodes+of+the+family+Steinernematidae.">The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae.</a> Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).</li><li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation.">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li><li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host,+Steinernema+carpocapsae.">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li><li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia.">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li><li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae.">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li><li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis.">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li><li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscheius+carolinensis+n.+sp+(Nematoda:+Rhabditidae),+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost.">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li><li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.,+sp.+nov.+(Rhabditida:+Rhabditidae),+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes.">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li><li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria.">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li><li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+insect+pathogen,+Photorhabdus+luminescens,+which+end+of+a+nematode+is+out.">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li><li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes.">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li><li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens.">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45 (2010).</li><li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus,+mad,+essential+for+symbiosis.">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li><li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization.">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li><li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004,+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes.">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li><li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes.">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li><li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes.">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li><li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila.">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li><li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB,+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism.">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li><li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K., Reddy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in General and Molecular Microbiology. , 394-419 (2007).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A., Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. , 239-269 (2009).</li><li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 375-425 (2012).</li><li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes.">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li><li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions:+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes.">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li><li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures.">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li><li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens,+which+end+of+a+nematode+is+out.">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li><li>Sicard, M., Brun, N. L. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts:+contrasting+types+of+interaction.">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li><li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins.">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li><li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors.">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li><li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms.">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li><li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria.">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li><li>Woodring, J. L., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steinernematid+and+Heterorhabditid+Nematodes:+A+Handbook+of+Biology+and+Techniques.">Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques.</a> Southern Cooperative Series Bulletin 331. , (1988).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan protokol bir evsahibi nematodu (Şekil 1) içinde bakteri optik tespit için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, nematod konak (Şekil 3) içinde bakteri in vivo analizi sağlayan, nematod optik şeffaflık ve floresan etiket bakterilerin yeteneği yararlanır. Özellikle, bu yaklaşım onun konak içinde bakteriyel yerelleştirme tanımlar. Bakteriyel varlığı için bir nematod popülasyonu ve puanlama sayarak, nematod popülasyonu üzerinde bakteri kolonizas...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Lipid Agar (Steril) </td><td></td><td></td><td> 8 gram besin suyu, 15 gr agar, 5 gr maya ekstresi, 890 ml su, 10 ml 0.2 g / ml &#39;MgCI2. 6H 2 0, 96 ml mısır şurubu çözelti *, 4 ml mısır yağı * Plakalar dökerken medya Stir * Otoklav sonrası steril madde ekleyin </td></tr><tr><td> Mısır Şurubu Çözüm (Steril) </td><td></td><td></td><td> 7 ml mısır şurubu, 89 ml su mix ve otoklav </td></tr><tr><td> Yumurta Çözüm </td><td></td><td></td><td> 16.6 ml% 12 sodyum hipoklorit, 5 ml 5M KOH, 80 ml su </td></tr><tr><td> Lysogeny Broth (Steril) </td><td></td><td></td><td> 5 g maya ekstresi, 10 g tripton, 5 g tuz, 1 L su mix ve otoklav </td></tr><tr><td> Mikrofuge&#39;de </td><td> Balıkçı </td><td> 13-100-675 </td><td> Mikrofuge&#39;de tüpleri tutan Herhangi mikrofuge&#39;de çalışacak </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman </td><td> 366802 </td><td> 15 ml ve 50 ml konik tüpler tutan Büyük masa üstü santrifüj </td></tr><tr><td> Steril 60 mm X 15 mm Petri Dish </td><td> Balıkçı </td><td> 0875713 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml santrifüj tüplerine </td><td> Balıkçı </td><td> 05-539-6 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml santrifüj tüplerine </td><td> Balıkçı </td><td> 05-531-6 </td><td></td></tr><tr><td> Steril 100 mm X 20 mm Petri Dish </td><td> Balıkçı </td><td> 0875711Z </td><td> Standart Petri kutularına daha derin </td></tr><tr><td> 24-kuyulu plakalı </td><td> Greiner Bio-One &lt;/ Td&gt; <td> 662000-06 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td></td><td></td><td> Mikroskop sizin fluorofor ile floresan yetenekleri uyumlu ihtiyacı </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> PBS (Steril) </td><td></td><td></td><td> 8 g NaCl 0.2 g KCL 1.44 g Na 2 HPO 4 0.24 g KH 2 PO 4 1 L su 7.4 ve su 1 L ve otoklav bir pH &#39;ye ayarlayın </td></tr><tr><td> Mikrofuge&#39;de tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 05-408-138 </td><td> 2 ml veya 1.5 ml tüpler </td></tr><tr><td> Shaker </td><td></td><td></td><td> Sıvı hafifçe hareket etmesine neden oluyor herhangi çalkalayıcı çalışır </td></tr><tr><td> Diaminopimelic asit </td><td> Sigma </td><td&gt; D-1377 </td><td> Gerekirse, bir konsantrasyon veya 1 mM medya takviyesi </td></tr></tbody></table>

visualizing bacteria in nematodes using fluorescent microscopy

Symbioses, iki veya daha fazla organizmaların birlikte yaşama, yaşamın tüm krallıkları boyunca yaygındır. Dünyanın en her yerde organizmaların iki olarak, nematod ve bakteri bu aralıktaki faydalıdır 1-3 patojenik simbiyotik dernekleri geniş bir dizi oluşturur. Böyle bir dernek Xenorhabdus bakteri ve sembiyoz 4 bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır Steinernema nematodlar arasındaki karşılıklı ilişkinin olduğunu. Steinernema nematod böcekler 5 öldürmek için onların bakteriyel symbiont kullanarak, entomopatojen vardır. Böcek bilgisayarlar arasında iletimi için, bakteri nematod en infektif juvenil evre 6-8 bağırsak kolonize. Son zamanlarda, birkaç diğer nematod türlerinin böcekler 9-13 öldürmek bakteri kullanmak gösterilmiştir ve araştırmalar bu sistemlerde nematodlar ve bakteriler arasındaki etkileşimleri inceleyerek başladık &lt;&gt; 9 sup. Biz mikroskobu ile izlendi nematodların optik şeffaflık yararlanarak, içinde veya bir nematod konak üzerindeki bir bakteriyel symbiont görselleştirme için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriler floresan mikroskobu kendi görselleştirme sağlayan bir floresan proteini ifade için tasarlanmıştır. Birçok plazmidler farklı dalga boyları (yani yeşil veya kırmızı) ve bir alıcı bakteri symbiont içine bir bağış Escherichia coli suşundan plazmidlerin konjugasyon az floresan proteinleri kodlayan genlerin bakterilerin geniş bir yelpazede için başarılı taşıdıkları mevcuttur. Açıklanan yöntemler Steinernema carpocapsae ve Xenorhabdus nematophila 14 arasındaki ilişkiyi araştırmak amacıyla geliştirilmiştir. Benzer yöntemler diğer nematod-bakteri dernekler 9, 15-18 araştırmak için kullanılan ve yaklaşım bu nedenle genellikle uygulanabilir edilmiştir. Method dernek ve kolonizasyon 14, 16, 19 sürecinin doğasını içgörü sağlayarak, farklı gelişim aşamalarında nematodlar içinde bakteriyel varlığı ve lokalizasyonu karakterizasyonu sağlar. Mikroskopik analiz dokular 14, 16, 19-21 barındırmak için bir bakteri nüfusu ve yerelleştirme içinde kolonizasyon sıklığı açısından ortaya koymaktadır. Bu, örneğin sonikasyon 22 veya kolonizasyon ortalama seviyesi sağlayabilir 23, öğütme gibi nematod popülasyonlarının içinde bakteri izlenmesi başka yöntemlere göre büyük bir avantaj, fakat, örneğin, popülasyonlarından düşük symbiont yüklerinin bir yüksek frekans ile popülasyonlar ayırt olmayabilir Yüksek symbiont yükleri düşük frekans. Kolonizasyon fenotipleri 21 bakteriyel mutantların tarama veya karakterize ederken frekans ve kolonize bakteri yükü farklılaştırması özellikle önemli olabilir, 24. Gerçekten de, floresan mikroskobu kolonizasyon, 17, 18 kusurlar için bakteriyel mutant yüksek verimli tarama teknikleri kullanılmaktadır ve sonikasyon 22, 25-27 ve bireysel nematod disseksiyon 28, 29 de dahil olmak üzere diğer yöntemler, daha az zahmetli bir iştir edilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Arasındaki karşılıkçılık incelenmesi<em&gt; Xenorhabdus</em&gt; Bakteri ve<em&gt; Steinernema</em&gt; Nematodlar, yöntemler bakteri varlığı ve nematod içindeki konumunu izlemek için geliştirilmiştir. Diğer sistemlere de uygulanabilir deneysel yaklaşım, mühendislik bakteri saydam nematod içinde floresan mikroskobu kullanarak, bakteri, yeşil floresan protein ve görselleştirme ile ifade gerektirir.

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

visualizing-bacteria-in-nematodes-using-fluorescent-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. Arasındaki karşılıkçılık incelenmesi Xenorhabdus Bakteri ve Steinernema Nematodlar, yöntemler bakteri varlığı ve nematod içindeki konumunu izlemek için geliştirilmiştir. Diğer sistemlere de uygulanabilir deneysel yaklaşım, mühendislik bakteri saydam nematod içinde floresan mikroskobu kullanarak, bakteri, yeşil floresan protein ve görselleştirme ile ifade gerektirir.

Video: Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biyoloji

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.