Biz UAB Cilt Hastalıkları Araştırma Merkezi (C. Elmets için P30 AR050948), UAB-UCSD O&#39;Brien Akut Böbrek Hasarı Merkezi (P30 DK079337 A. Agarwal için kısmen desteklenmiştir UAB Hedefli Metabolomik ve Proteomik Laboratuvarı, teşekkür ederim ) ve UAB Akciğer Sağlığı Merkezi (R01 HL114439, R01 HL110950 JE Blalock için). Kütle spektrometresi desteği bir NCRR Paylaşılan Araçları hibe (S. Barnes için S10 RR19261) oldu. Ayrıca teknik destek için Ray Moore teşekkür ederim. C. elegans suşları NIH tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlandı. Bu çalışma NIH (bir arra idari ek dahil olmak üzere R01GM085105 için MAM,) tarafından desteklenmiştir.

Solucanı kültürü, prostaglandin ekstraksiyon ve prostaglandin analizi: Aşağıda tarif edilen protokole üç bölüme ayrılmıştır. Belirtildiği gibi örnekleri geçici olarak -80 ° C veya -20 ° C&#39;de saklanabilir zaman, birden fazla nokta vardır 1. Worm Kültür Biz kapsamlı LC-MS/MS karışık aşamada solucanlar yaklaşık 6 gr tavsiye ederiz. Bu saptama, en az altı ayrı enjeksiyon için yeterli malzeme sağlamalıdır. Tek bir enjeksiyon ya da iki MRM tarafından bilinen PG ölçümü için, 1-2 gram yeterli olacaktır. Belli bir aşamada oluşan senkronize kültürleri özler analizi, aynı zamanda mümkündür. Kadar 4 farklı suşları aynı anda yetiştirilebilir. Örneğin, bir vahşi tipli kontrol ve üç farklı mutant. <ol><li> Tamamlayıcı beslenme için 65 (16 cm) X-büyük NGM plakalar ve konsantre bakteri hazırlayın. Tohumlama için NA22 bakteri kullanın. Tamamlayıcı beslenme, Gro için konsantre bakteri yapmak için16-24 saat boyunca LB ortamı içerisinde NA22 w en az dört litre. Aşağı doğru döndürün, M9 tampon 100 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon bakterileri yok. Bu konsantre bakteri çözeltisi 200-400 ml her biri sonsuz bir suş için gerekli olabilir. 4 ° C&#39;de saklayın </li><li> 5 X-büyük plakaları üzerinde solucan kültür başlayın. Plakaları gebe yetişkinlerin tam kadar yaklaşık 3 ila 4 kuşaktır solucanlar büyütün. Konsantre bakteri açlık önlemek için plakaları eklenir, gerektiğinde (~ 1 ml / plakası ve kapak takmadan önce cihazın tamamen kurumasını bekleyin). Olmalıdır </li><li> M9 tamponu ile plakalar gebe çift cinsiyetli yıkayın ve bir 50 ml konik polipropilen tüp solucanları toplamak. </li><li> Gebe çift cinsiyetli alt (genellikle 3-5 dk) yerleşmek için izin verin. Bakteriler, yumurta ve larva aşamasında solucanlar dahil olmak üzere, süpernatantı. 15 ml M9 tampon tekrar süspansiyon ve hafifçe karıştırın. </li><li> 60 tohumlu NGM plakalar her birine solucan süspansiyonu 200 ul aktarın. Plakalar arasındaki solucanlar dağıtılır. Solucan çözüm karışık tutunde tüm plakaları kadar onlar solucanlar kabaca eşit sayıda aldığınızdan emin olmak için numaralı seribaşı edilmiştir. </li><li> Açlık önlemek için gerekli (~ 1 ml/plate/12 için 24 saat süre) olarak konsantre bakteri ile Ek. Tabak kapakları değiştirmeden önce kurumaya bırakın. Plakaları gebe yetişkin dolu numaralı seribaşı solucanlar orijinal sayısına bağlı olarak, 2-4 nesiller için solucanlar büyümek, ya da kadar. </li><li> Hasat solucan plakaları her seferinde bir suşu. M9 tamponu ile plakalar solucanlar yıkayın ve 50 ml polipropilen tüpleri (örneğin 6 tüpler) toplamak. Bir tabak yıkamak için M9 tampon kullanın, sonra bir sonraki plakasına solucan dolu tampon aktarın. Plaka bir dizi (örneğin,. 10.) yıkandıktan sonra, 50 ml tüp solucan dolu tampon aktarın. M9 tampon ile üst tüpün doldurun. Plakaların geri kalanı için yıkama tekrarlayın. </li><li> Gravid yetişkin 5-6 dakika içinde dibe olarak, sıvı (~ 35 mi) kaldırmak ve bir ya da iki tüp içine birleştirmek. Fr ile 50 ml tüplere doldurunESH M9 tampon, 3-5 dakika bekletin, ve süpernatant bırakarak gebe yetişkin kaldırın. 3 kez tekrarlayın veya süpernatant saydam oluncaya kadar. </li><li> Büyük bir delik Pasteur pipeti, iki 15 ml polipropilen konik tüpler için mümkün olduğunca çok sayıda solucan gibi havalesi ile. Bir klinik santrifüj 5 dakika boyunca 1000 RCF (CentraSL2 içinde ~ 3500 rpm) aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve solucanlar aynı tüpte aktarılır ve pelet kadar tekrarlayın. -80 Mümkün ve mağaza solucanlar kadar süpernatant olarak kaldırmak ° C Tüm suşlar için tekrarlayın. </li></ol> 2. Prostaglandin Ekstraksiyon Çıkarılması için gerekli ayıraçlar aşağıda gösterilmiştir. Bu yöntem Golovko Murphy 17 değiştirilmiş bir ve LC-MS/MS hassasiyeti artırır sıvı-sıvı temizleme, ardından aseton ekstraksiyonu içerir. Benzer sonuçlar, bir Dounce homojenizatör ile elde edilebilir, ancak bir mermi blender 5 homojenleştirici prosedür kullanılır. Bütillenmiş hydroxytolueNE (BHT) ve azot altında buharlaştırma (N2) gaz, oksidasyon önlemek için kullanılır. Tüm cam lipid bağlayıcı azaltmak için (Sigmacote) silikonlu olmalıdır. Organik çözücü ile özünün çıkarılması kimyasal bir kaput yapılmalıdır. <ol><li> , 50 ml polipropilen konik tüpe tartılır. 6.5 ml işareti yakın sıcak bir jilet ile tüp aracılığıyla keserek -80 ° C&#39;de saklanan 15 ml konik tüp dondurulmuş solucanlar yaklaşık 6.0 g aktarın. Bir metanol-temizlenmiş spatula tüpün altındaki dondurulmuş pelet solucanı kaldırmak için kullanılabilir. Pelet üst alt kısmının, daha az yoğun larva solucanlar ve kalan bakteriler almak için pelet keserek geride bırakılır. </li><li> Önceden tartılmış 50 ml konik tüp, donmuş solucanlar aktarın. Birden fazla numune işleme edilmektedir, karşılaştırmalı çalışmalar için doku aynı miktarda (6.0 g) kullanın. Bir hamur içine solucanlar çözülme gibi, istenen kitle elde etmek için spatula ile solucanlar eklemek veya kaldırmak. İsteğe bağlı: Reklamekstraksiyon verimlilik için bir iç kontrol olarak PGF 2α-d4 standart d 1.00 ng. </li><li> Solucan süspansiyon 0.005% BHT ile buz gibi soğuk 02:01 aseton / serum fizyolojik 12 ml ekleyin ve karıştırın iyice karıştırın. Mermi blender içinde kullanım için oniki 5 mi kendine ayakta plastik tüplerin her solucan bulamacın 1.5 ml dağıtın. </li><li> 0.5 mm 0,7-0,8 ml çapında Ceria her 5 ml tüp zirkonyum oksit boncuk stabilize. Sıkıca kapakları kapatın ve Bullet Blender 5 homojenizatör içine 12 tüpler yükleyin. Hızlı 8-9 az 3 dakika için blender çalıştırın ve Tüpler buz üzerine yerleştirin. Çok sıkı kapakları kapatmak için ya da içeriği dökülebilir emin olun. Bir Stereoskop kullanarak bir slayt üzerinde bir tüpten homojenatında 10 ul kontrol edin. Kalan çok az sağlam solucan olmalıdır. Gerekirse, bir dakika için aynı hızda tekrarlayın. </li><li> Eşit bir 9 &quot;Pasteur pipeti kullanarak dört adet 10 ml konik cam tüpler için homojenatlarında aktarmak. Transfer boncuk kaçının. Üç tüp seque gelen boncuk yıkayınntially 01:02 aseton / tuzlu su içeren BHT 1 ml. Tüm boncuk yıkanır kadar diğer tüpler için tekrarlayın. 10 ml cam tüplere kalan çözelti (~ 4 mL) aktarın ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> 4, 10 ml cam tüpler Santrifüj ° C de 10 dakika boyunca ~ 1000 xg&#39;de bir klinik santrifüj. Her bir tüp, temiz bir 10 ml&#39;lik bir cam konik tüp süpernatant aktarın. </li><li> Kimyasal bir başlık olarak, her bir 10 ml bir cam tüpe heksan eşit hacimde ekleyin. Örneğin, 3.5 ml aseton / tuzlu su çözeltisi için 3.5 mL heksan ilave edin. 30 saniye için maksimum hızda Vortex. </li><li> 4, 10 ml cam tüpler Santrifüj ° C de 10 dakika boyunca ~ 1000 xg&#39;de bir klinik santrifüj. Hekzan içeren üst faz ve nötr ücret lipidler atın. </li><li> 2 M formik asit (- 150 ul, yaklaşık 100) kullanılarak pH 3.5 &#39;e asitlendirilir alt faz. PH şeritleri kullanarak test pH. </li><li> Her tüpe kloroform eşit hacimde ekleyin. 30 saniye için maksimum hızda Vortex ve 4 tüpler santrifüj ° C i10 dakika boyunca ~ 1000 xg&#39;de na klinik santrifüj. </li><li> Çıkarın ve üst sulu faz atın. Interfaz kaçınarak, alt kloroform fazına kalan sütlü interfaz ile bir pipet takın. Temiz bir 15 ml konik cam tüpe 4 tüplerin her biri ikinci alt aşama toplayın. En az 24 saat boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. Bu noktada, özü iki haftaya kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Dondurucu özü çıkarın ve varsa, kalan sütlü sulu üst tabaka atın. Yeni bir Pasteur pipet kullanarak Teflon kaplı etiketli ½-Dram cam şişe için kloroform faz aktarın. Kimyasal bir kaput, N2 gazı hafif bir akımı altında kuruyana kadar kloroform çözünebilir fraksiyon buharlaşır. Kuru ekstresi, 2 haftaya kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. PG çıkarma ve analiz için kullanılan genel bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. </li></ol> 3. Prostaglandin Analizi <ol><li> Stok hazırlayınçalışan bir çözelti elde etmek için su (8:2 h / h): bu 2α PGF ya da PGF 2 metanol içinde α-D4 (1 ug / ml) olarak ve metanol ile seyreltilir özel referans prostaglandinlerin çözümler. Bir standart eğri oluşturmak için bir seri seyreltilmesi (100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng / ml) hazırlayın. </li><li> Kurutuldu C. su (8:2 h / h): 200 ul metanol ekleme elegans lipid özü (ler) ve iyice karıştırın. Su solüsyonu: sonsuz doku az 6 g ekstre edildi durumunda, kuru ekstresi metanol daha az bir hacimde yeniden asıldı edilmelidir. </li><li> Su içinde% 0.1 formik asit içeren, mobil faz hazırlanır [A] ve% 0.1 formik asit ihtiva eden asetonitril [A]. </li><li> 4 ° C de otomatik örnekleyici kurmak ve bir 70-sayısı 1.5 ml şişe rafa örnek şişeleri yerleştirin. </li><li> Yaklaşık 5 dakika boyunca, 0.2 ml / dk &#39;lık bir akış oranında% 0.1 formik asit ile Sinerji hidro RP-C18 kolon dengelenmesi. </li><li> Sütuna örnek (20-50 ul) enjekte edilir. Gradyan elüsyon başlangıç ​​yapmaking% 10 B ve 0-11 dakika, 11-14 dk% 80-100 B, 80% B kadar gidiyor ve 16 dk% 10 B geri dönen. Toplam çalışma süresi 20 dk. 13 özgün standartları tutma süreleri referansı 3 için Tablo 1 &#39;de gösterilmektedir. </li><li> Negatif iyon modunda ise, bir ESI arabirim işletim kullanarak, kütle spektrometresi içine atık sütun tanıtılması. Azot nebulizer ve perde gazı (KKO = 10) olarak kullanılır. Çarpışma gaz, çarpışma enerji ve sıcaklık sırasıyla 10, -35 eV ve 600 ° C de ayarlanır. Declustering potansiyeli (DP), çarpışma enerjisi (CE), ve hücre çıkış potansiyeli (CXP) sırasıyla -90, -35 ve -10 ayarlanır. </li><li> Anket taramaları (Q1 taramaları) için, en PG (Şekil 2) için m / z 315-360 kütlesi aralığında negatif iyon modunu kullanın. Aralık ilgi bileşik (ler) kütlesine bağlı olarak değiştirilebilir. LC-MS iyon kromatogramların toplam iyon akımı (TIC) den iyonları ve belirleyen extrac olsunted iyonları ya da deprotone yaklaşımlı iyonları uygun ya da fragmanı iyonları. </li><li> MRM deneyler için, geçiş kütle m / z 355/311 F1 sınıfı tespit etmek için kullanılan, m / z 353/193, F2 sınıf için kullanılır ve m / z 351/193 ya da 351/191 F3 sınıfı için kullanılan (Şekil 3). MRM ayrıca, iç standart (örneğin, m / z 357/197 PGF 2α-D4) tespit etmek için ve standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır. PG kitle geçişler 18 hakkında daha fazla bilgi için Murphy ve ark. Bakın. </li><li> MS / MS deneyler için, F1 sınıfı, m / z 353for F2 sınıfı, ve m / z 351for F3 sınıfı PG için m / z 355 kullanın. C. F-serisi PG için elegans, MS / MS verileri, Şekil 4 ve Tablo 2, 3,16 mevcuttur. Memeli eikozanoidler için MS / MS veri mevcuttur <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a> . </li><li> Analys kullanarak analitik veri işlemet yazılım (Sürüm 1.4.2, Applied Biosystems). </li></ol>

<ol>
	<li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans.">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).</li><li>Marza, E., Lesa, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+and+neurotransmission+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).</li><li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/FOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction.">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li><li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP(3)-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans.">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).</li><li>Kosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eicosanoid+formation+by+a+cytochrome+P450+isoform+expressed+in+the+pharynx+of+Caenorhabditis+elegans.">Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. J. 435, 689-700 (2011).</li><li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo.">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473, 226-229 (2011).</li><li>Gerisch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bile+acid-like+steroid+modulates+Caenorhabditis+elegans+lifespan+through+nuclear+receptor+signaling.">A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).</li><li>Edison, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+pheromones+regulate+multiple+complex+behaviors.">Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).</li><li>Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandins+and+leukotrienes:+advances+in+eicosanoid+biology.">Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.</a> Science. 294, 1871-1875 (2001).</li><li>Wang, D., Dubois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eicosanoids+and+cancer.">Eicosanoids and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).</li><li>Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+prostanoids:+deciphering+the+developmental+functions+of+cyclooxygenase-derived+prostaglandins.">Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins.</a> Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).</li><li>Hata, A. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+and+signaling+of+prostaglandin+receptors:+multiple+roles+in+inflammation+and+immune+modulation.">Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation.</a> Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).</li><li>Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+function+of+prostanoid+receptors:+studies+from+knockout+mice.">Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.</a> Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).</li><li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprostanes:+novel+bioactive+products+of+lipid+peroxidation.">Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation.</a> Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).</li><li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogenous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+C.+elegans+reproductive+tract.">A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).</li><li>Golovko, M. Y., Murphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+LC-MS/MS+procedure+for+brain+prostanoid+analysis+using+brain+fixation+with+head-focused+microwave+irradiation+and+liquid-liquid+extraction.">An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction.</a> J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).</li><li>Murphy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+and+tandem+mass+spectrometry+of+eicosanoids.">Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids.</a> Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).</li><li>Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+biochemistry+of+the+isoprostane+pathway.">Human biochemistry of the isoprostane pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).</li><li>Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+metabolism+of+eicosapentaenoic+acid+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması var.

Biz F-serisi PG odaklanarak, eicosanoid çıkarma ve analiz için bir prosedür açıklanmaktadır. Sorunlu olabilir prosedürün çeşitli yerlerinde bulunmaktadır. Birincisi, açlık PG metabolizmasını değiştirebilir gibi solucan kültür, açlıktan yok önemlidir. NA22 yüksek yoğunluklu ulaştığı için, tamamlayıcı besleme için, NA22 bakteri yerine daha yaygın olarak kullanılan OP50 bakteri tavsiye edilir. Ancak, NA22 gerginlik antibiyotik direnci yoksun ve kirlenmeye daha hassastır. İkinci olarak, solucanlar memeli dokularında göre düşük bolca bireysel PG izomerleri sentez. Bunun nedeni, kısmen çok sayıda izomerler arasında fazlalık bağlı olabilir. Biz kapsamlı bir analiz ve güçlü sinyaller için doku yaklaşık 6 gr tavsiye ederiz. Kuru ekstresi az metanol içinde süspansiyon haline getirildi, daha az doku (1-2 g) kullanılabilir: su çözeltisi PG konsantrasyonunu artırmak için. Bununla birlikte, sadece 1-2 enjeksiyon yapılabilir. Bizim LC-MS/MS sisteminin saptama limiti 10 pg hakkındaPGF 2α / ml arasındadır. Yoğun dolu karışık aşamada solucanlar biri ml (yaklaşık 1 gr) CePGF2 yaklaşık 25-50 pg verir. Daha hassas kütle spektrometresi sistem analizi için gerekli solucan doku miktarını azaltabilirsiniz. Üçüncü olarak, örnekleri arasında PG ekstraksiyon verimi farklılıklar değişken sonuçlara neden olabilir. Bu ekstraksiyon verimi dokularda paralel ekstre zaman çok benzer olduğunu bulduk. Etkinliğini belirlemek için, bir iç kontrol olarak, homojenleştirme adımı da PGF 2α-D 4, 1.0 ng ekleyin. MRM m / z 357/197, 1 ng / ml standart çözeltiye göre PGF 2α-d4 konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan kütle geçişi kullanılarak. Çıkarma sırasında kaybolan PGF 2α-d 4 miktarı daha sonra hesaplanır. Biz dahil kromatografi parametreleri ve kitle geçişler diğer PG ve eikozanoidler tespit etmek için değiştirilebilir. Önemli çaba rağmen, D-serisi veya e-ser tespit etmek mümkün olmamıştırler ekstreler 17 syf. Ayrıca, 8-iso PGF 2α ve PG stereoizomerler 19 seçici olmayan bir karışım oluşturur serbest radikal tarafından başlatılan peroksidasyonu, karakteristik 8-iso PGE 2 tespit değil. Solucanlar diğer PG tür sentez olmadığı bilinmemektedir. Endokannabinoidlerin ve araşidonik ve eikosapentaenoik asit çeşitli epoksi ve hidroksi metabolitleri C bulunmuştur elegans 5,7,20,21 ayıklar. Biz sırasıyla, ölçme ve tanımlama için otantik standartlarına göre MRM ve MS / MS hem de kullanmanızı tavsiye ederiz. Yeni eikosanoidlerin için, bu analizler, mümkünse, enzimler 22, hem de bir işlevsel analiz sentez PUFA eksik olan yağ mutantlar, karşılaştırmalı bir çalışma ile kombine edilmelidir. Yağ mutantlar analiz için bir uyarı solucanlar bulunan PUFA bir dakika miktarda PG sentezi için yeterli olmasıdır. Örneğin, yağ-2 (wa17) mutantlarD12 desatüraz aktivitesinin küçük bir miktarda (~ 5 vahşi tip 22%), ve bu mutantların hala PG 6 üretir. yağ-3 (wa22) ve yağ-4 (WA14) mutantlar arakidonik asit, eikosapentaenoik 16 türetilmiş PG sentezi için başarısız olması . Ayrıca yağ mutantlar kalan sınıflardan düzenleyen PG sentezini PUFA&#39;nın sınıfların kaybını telafi bulduk. Örneğin, yağ-3 (wa22) mutantlar 20-karbon ÇDYA elde edilen en PG sentez için başarısız. Bunun yerine, 18-karbon PUFA 16 türetilmiş yeni PG up-regüle görünmektedir. Bugüne kadar, bir C belirlenememiştir PG sentezini tamamen eksik olan elegans suşu. Bu PG büyüme ve gelişme için gerekli olan mümkündür.

Prostaglandinler (PG) yoğun bir şekilde araştırılmıştır ve organizmaların 12-14 geniş bir dizi üreme, bağışıklık ve gelişim düzenlenmesinde suçlanmıştır lipid hormonların önemli bir sınıfıdır. Bunlar, ortak bir ön-madde (ler) den elde edilen lipidlerin bir dizi oluşturan nedeniyle PG ideal kapsamlı sistem biyoloji analizler için uygundur. Nematod ° C. elegans genetik ve sistem biyolojisi temel soruları için en yaygın olarak kullanılan model organizmalar biridir. Bu çalışma sonucunda C. elegans F-serisi PG sentezler bu oosit 3,6,16 için hareketli sperm kılavuzu. Sırasıyla, üç, dört ve beş çift bağ, F1 ihtiva eden, F2, F3 sınıflar, 20-karbon PUFA elde edilen F-serisi PG 3,16 tespit edilmiştir. Bu PG siklooksijenaz enzimler bağımsız olarak sentezlenmiş ama PGF 1α ve PGF, 2α stereoizomerler de ge vardırnerated. C. kalitatif ve kantitatif analizleri için elegans PG, LC-MS/MS güçlü ve duyarlı bir analitik tekniktir. Bu analiz yapmadan önce, bu analitik sürecin performansı ağır özü kalitesine bağlıdır çünkü optimize edilmiş bir ekstraksiyon yöntemi geliştirmek önemlidir. Sıvı kromatografi ve kütle spektrometresi yalnızca oranı (m / z) şarj etmek için beklenen kitle, hem de PG ana iyonu arasında arzu edilen bir tepe şekli ve saklama süresi sağlayabilir. C. PG metabolik profil elegans çeşitli MS satın alma stratejileri gerektiren zor bir iştir. LC-MS tam tarama veya anket tarama (Q1 tarama) çoğu iyonize PG bir kitle spektrometrik yanıt üretecektir sağlanması avantajına sahiptir. Araştırma tarama yabani tip ve mutant C ile ilgili PG toplam profil hakkında bilgi sağlar iken elegans, küçük PG algılama düşük hassasiyeti nedeniyle tehlikeye düşer. Buna rağmendaha az, LC-MS anket tarama PG küresel bir görünüm vermek ve büyük bir PG nüfusun metabolizmasını etkileyen tahmin mutantlar analiz için yararlıdır olabilir. Metabolizma tanımlama olarak, kimyasal olarak sentezlenmiş bir PG standartların LC-MS/MS analizine göre, referans bileşikleri gibi, ürün iyon spektrumları elde etmek için gerçekleştirilir. Bu spektrum, bilinmeyen bir metaboliti spektrumuna karşılaştırılabilir. Çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM) modu daha iyi bir hassasiyet ve özgüllük için kullanılır. MRM bir deney, bir bileşiğin, ana iyonu / ürün iyon kütle geçişi belirleyerek gerçekleştirilir. Hedef analitlerin kütle ve yapısı bilerek, çok bilinmeyen metabolitleri için teorik MRM geçişleri tahmin etmek mümkündür. C. izomerik PG profil için optimize edilmiş bir LC-MS/MS yöntemi elegans bildirilmemiştir. Burada, LC-MS ve oluşan bir ekstraksiyon ve entegre bir kütle spektrometresi yaklaşım tarif LC-, Tespit miktarının, ve C araştırmak için MS / MS yöntemleri elegans PG metabolitleri. Bu yaklaşım, başka bir eikosanoidlerin uygulanabilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-large (16 cm) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875714</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain NA22</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>NA22</td>
			<td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, 399.5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A928-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butylated Hydroxytoluene</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101162</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, 399%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC27048-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC26832-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2&alpha;-d4</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>316010</td>
			<td>Cayman has a wide array of standards available for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile screw cap self-standing 5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-651</td>
			<td>For use with Bullet Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>ZrOB05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes</td>
			<td>Kimble Kimax</td>
			<td>45200-10</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml glass conical tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>8082-15</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote (Siliconizing reagent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V1235C-TFE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentraSL2 Clinical Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>2517N92-TS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender 5 blue homogenizer</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>BBY5MB</td>
			<td>A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergi 4 &mu;m Hydro-RP 80 &Aring; LC Column 250 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>00G-4375-B0</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>AJ0-7510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Guard Cartridges Kit</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>KJ0-4282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler</td>
			<td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 4000 triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">M9 buffer recipe (4 liter)</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>12 g</td>
						<td>KH2PO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 g</td>
						<td>Na2HPO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>20 g</td>
						<td>NaCl</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Up to 4 liter</td>
						<td>Deionized water</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool.</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>0.5 ml/bottle</td>
						<td>1 M MgSO4</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prostaglandin extraction and analysis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans lipidler 1-9 biyolojisi okumak için güçlü bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Prostaglandinler, çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) 10-14 türetilmiş lipit sinyallerdir eikosanoidlerin önemli bir sınıfı vardır. Bu sinyal molekülleri nedeniyle düşük bolluk ve reaktif doğanın çalışma zordur. Prostaglandin karakteristik özelliği, yağlı asit omurga içinde yer alan, bir siklopentan halka yapısıdır. Memelilerde, prostaglandinler siklooksigenaz-bağımlı ve bağımsız yol 10,15 yoluyla oluşturulabilir. ° C. elegans siklooksijenazların 6,16,17 bağımsız prostaglandin geniş bir dizi sentezler. F-serisi prostaglandinlerin büyük bir sınıfı tespit, ama eikozanoidler çalışma yeni keşifler için bol bol yer ile erken bir aşamada değil. Burada prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz etmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Ücretli lipids, bir sıvı-sıvı ekstraksiyon tekniği ile kütle solucan kültürlerden gelen ekstre edilmiş ve bir elektrosprey iyonlaştırmalı tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) birleştirilmiş sıvı kromatografisi ile analiz edilir. Gibi α-D 4 PGF 2 gibi prostaglandinlerin döteryumlu analogları dahil edilmesi, dahili bir standart kantitatif analiz için tavsiye edilir gibi. Çoklu reaksiyon takip işlemi veya MRM yabani tip ve mutant hayvanlar arasındaki spesifik prostaglandin tipi ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Çarpışma bağlı ayrışma veya MS / MS önemli yapısal özellikler hakkında bilgi elde etmek için kullanılabilir. Sıvı kromatografi kütle spektrometrisi (LC-MS), m / z 315-360 olarak seçilen bir kütle aralığı diğer taramalar prostaglandin seviyeleri küresel değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Hepimiz üç analizlerin örnekler sağlar. Bu yöntemler yeni eikozanoidler keşfetmek ve metabolik yollar sınırlarını belirleyen bir araç ile araştırmacılar sağlayacaktır.

Numune hazırlama Golovko Murphy 17 uyarlanmış sıvı-sıvı ekstraksiyon gerçekleştirilmiştir. Bu, dahili bir standart (PGF 2α-d4) arasında mükemmel bir iyileşme sağlanmaktadır. C. PG çıkarılması için genel şeması elegans, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Kromatografik koşullar&gt; 30 eicosanoid standartları (Tablo 1 13 standartları gösterir) bir temel ayrımı sağlamak için optimize edilmiştir. % 0.1 formik asit ihtiva eden su ve asetonitril ile bir hidro-RP kolon (250 x 2.0 mm İD), en iyi ayırma ve hassasiyeti sağlanır. Yabani tip ve yağ-3 mutant özler diğer taramalar 315-360 atomik kütle birimi kütle aralığı içindeki iyonların Şekil 2, belge küresel düzeyde gösterilmiştir. Yağ-3 (wa22) mutantlar çok 20 karbon PUFA yoksundur. Bir F3 sınıf PG vurgulanır. Şekil 3&#39;te, bir vahşi-tip özü MRM analiz F1 birden fazla PG izomerleri (Şekil 3A göster </stro<html> ng&gt;), F2 (Şekil 3B) ve F3 (Şekil 3C ve 3D) sınıfları. F3 sınıfı iki kitle geçişler biri ile tespit edilebilir, m / z 351/193 veya m / z 351/191. CePGF2 ağırlıklı PGF 2α enantiomerin oluşur. CePGF1 PGF 1α veya enantiyomeri olması muhtemeldir. Şekil 4 CePGF2 en çarpışma kaynaklı ayrışma (RT = 11.8) PGF2 α standardına göre (RT = 11.8) gösterir. Ürün iyonları küçük farklar büyük olasılıkla özü düşük CePGF2 bolluğu ve ortak salınımlı bileşikleri ile kaynaklanmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> Şekil 1. C. şematik diyagramı elegans PG çıkarma ve LC-MS analizleri. Her iki yağ oksidasyonunu en aza indirgemek için% 0.005 &#39;lik BHT sahip aseton / tuzlu su ve kloroform unutmayın. Daha fazla bilgi için metne bakın.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> Şekil 2. Yabani tip ve yağ-3 (wa22) mutant özler m / z 315-360. Sıvı kromatografi tutma süresi (RT) arasında diğer taramalar paneli [A] &#39;de gösterilmektedir. Oda sıcaklığında Çıkarılan iyonları = 11.3 yabani tip [B] ve yağ-3 (wa22) [C] özleri için gösterilmiştir. Kütle m / z 351 ile F3 sınıf PG vurgulanır. Cps, sayım / sn; amu, atomik kütle birimi. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> Incirure 3. Vahşi tip özler MRM analizleri. F1 sınıfı PG kütle geçiş m / z 355/311 [A] ile tespit edilir. PG olması olası birkaç hidrofobik bileşikler (RT&gt; 14 dk), bu geçiş ile tespit dikkat edin. F2 sınıfı PG kitle geçiş ile tespit edilir m / z 353/193 [B]. F3 sınıf PG ya kitle geçiş ile tespit edilir m / z 351/193 [C] veya m / z 351/191 [D]. Özler her sınıfın birden çok PG izomerleri içeren dikkat edin. Sayılar Tablo 2&#39;de gösterilmiştir PG karşılık gelmektedir. CePGF2 konsantrasyonu 1.8 ng / ml &#39;dir. RT, tutma süresi; cps, sayım / saniye. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> Şekil 4. Kimyasal synth çarpışma kaynaklı ayrışmaPGF 2α ve CePGF2 esized. panelindeki Oklar [A] PGF 2α ve CePGF2 (RT = 11.8) arasında paylaşılan ürün veya parçalanma iyonları gösterir. M / z 309 ve m / z 193&#39;de ürün iyonları gösterilen yapılara karşılık belirtilen yarılma bölgeleri (a ve b gösterilmiştir) tarafından üretilen, ve F-serisi PG karakteristik [A]. Edilir Cps, sayım / sn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Standart </td><td> RT (dk) </td><td> [MH] - m / z </td><td> MS / MS anahtar ürün iyonları </td></tr><tr><td> 20-hidroksi PGE2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> B 2 tromboksan </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319.311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoksin B 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191.189, 165, 155, 115, 107, 71, 59. </td></tr><tr><td> PGT 2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - A 4 Lipoksin </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59. </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Lökotrien B 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HpETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Saklama süreleri ve LC-MS/MS yöntemi 3 13 eicosanoid standartlarının önemli ürün iyonları. 30 standartları LC-MS/MS programı geliştirmek için kullanılmıştır. Kromatografik tutma kez (RTS) bile çok benzer PG arasında, farklılık. Bir istisna PGF 1α ve PGF 2α olduğunu. Bununla birlikte, bu PG d vardır(- m / z [MH]) ve çarpışma kaynaklı ayrışma spektrumları (MS / MS), üst iyon kitleler tarafından istinguished. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Prostaglandin sınıf </td><td> Şekil 3, No </td><td> [MH] - m / z </td><td> MS / MS anahtar ürün iyonları </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> Tablo 2&#39;de. Birçok önemli C. için Çarpışma kaynaklı ayrışma ürünü iyonları elegans F1, F2, F3 ve PG, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Diğer daha az oranda izomerler MS / MS gösterilmemiştir. Bu veriler birden analizler ve tüm ürün iyonları belirli bir vadede görülebilir. Özleri karmaşıklığı göz önüne alındığında, biraz daha az bol ürün iyonları müdahalesinden benzer tutma süresi ya da sonuç ile başka bir ana iyon köken alabilir. Pik 2 olasılıkla CePGF1 bir stereoizomer ve pik 4 olasılıkla CePGF2 bir stereoizomer. Ek veri 3 Edmonds, ve ark. (2010) bakın.

Watch this Scientific Journal Video about Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Bu yazıda, prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz için optimize edilmiş bir prosedür tarif<em&gt; C. elegans</em&gt; LC-MS/MS kullanarak.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

prostaglandin-extraction-and-analysis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

19.5K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. Bu yazıda, prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz için optimize edilmiş bir prosedür tarif C. elegans LC-MS/MS kullanarak.

Video: Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Biyoloji

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

yetiştirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Laboratuvarı Üç boyutlu

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...