Bu protokol, mikroglia'yı yetişkin fare beyninin mikrodisseke demiyelinasyon lezyonlarından izole etmeye yardımcı olur ve mikroglial özellikleri in vivo olarak inceler. Bu teknik zamandan tasarruf sağlar ve hem deneyciler hem de ekipmanlar için daha düşük gereksinimlere sahiptir. Bu yöntem, mikroglia'yı hayvanın beyninden, özellikle de çeşitli hastalık durumlarındaki mikrodisseke dokuları izole etmeye yardımcı olur.
Korpus kallozumun etrafındaki nötr boya ile etiketlenmiş lezyonların stereomikroskop altında mikrodiseksiyonu ile başlayın. Tüpün dibindeki numuneyi toplamak için disseke edilmiş dokuyu 30 saniye boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın. Bir inkübatörde bir enzim karışımını önceden ısıtın ve enzim iki ila 37 santigrat derece karıştırın.
Daha sonra, 1.950 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim karışımı bir numuneye ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörde sindirim. 30 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim karışımı iki ekleyin ve yavaşça karıştırın. Sindirimden sonra, tüpe dört mililitre soğuk PBS ekleyin ve yavaşça çalkalayın.
Doku örneklerini dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın ve süpernatantı yavaşça ve tamamen aspire edin. Hücre peletini 1.550 mikrolitre soğuk PBS ile nazikçe yeniden askıya alın. Enkaz giderme için 450 mikrolitre soğuk çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.
Karışımı çok yavaş ve nazikçe iki mililitre soğuk PBS ile kaplamak için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Karışımı santrifüj edin ve ardından üç katmanı arayın. Üst iki katmanı tamamen aspire etmek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve tüpü beş mililitreye kadar soğuk yükleme tamponuyla doldurun.
Tüpü yavaşça üç kez ters çevirin. Daha sonra, süpernatanın santrifüjlenmesi ve aspirasyonundan sonra, hücre peletini 90 mikrolitre yükleme tamponu ile yeniden askıya alın ve 10 mikrolitre CD11b boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, bir mililitre yükleme tamponu ekleyin ve sıvıyı 1.000 mikrolitrelik bir pipetle yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetleyerek hücreleri yıkayın. Hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için süpernatantı tamamen aspire edin. Hücreleri yükleme tamponunun 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve manyetik alanda pozitif seçim için MS sütununu ayırıcısıyla birlikte yerleştirin.
Hücreleri korumak ve üreticinin protokolüne göre manyetik sıralamanın verimliliğini sağlamak için kolonu 500 mikrolitre yükleme tamponu ile durulayın. Hücre süspansiyonunu MS sütununa uygulayın ve etiketsiz hücreleri içeren akışı atın. Kolonu yıkamak için yükleme tamponundan 500 mikrolitre ekleyin ve ayırıcıdan çıkarın.
Sütunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve sütuna bir mililitre yükleme tamponu ekleyin. Son olarak, manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütunun altına doğru itin. Manyetikle aktive olmuş hücre sıralamasından önce ve sonra yetişkin farelerin demiyelinizasyon lezyonlarından izole edilen mikroglia'nın akış sitometri analizinde kullanılan geçit stratejisinin şematik bir temsili burada gösterilmiştir.
Grafik görüntüler, hücreleri seçmek için ileri saçılma yüksekliğini ve yan saçılma yüksekliğini, tek hücreleri seçmek için ileri saçılma alanını ve ileri saçılma yüksekliğini ve miyeloid hücreleri ve mikrogliayı seçmek için CD11b-FITC ve CD45-APC'yi temsil eder. Mikroglia oranı, manyetik aktive hücre sıralamadan sonra önemli ölçüde artmıştır. Grafik görüntü, manyetik aktive edilmiş hücre sıralamadan sonra canlı ve ölü tek hücreler için akış sitometrisi analizinde kullanılan geçit stratejisini temsil eder.
Burada, canlı hücreleri seçmek için 7-aminoaktinomisin D ve yan saçılma yüksekliği kullanılmıştır. Bu prosedürü denerken, nötr kırmızı işaretlere dayanan bir stereomikroskop altında demiyelinizan lezyonları tam olarak mikrodisseke etmeyi unutmayın.
