يساعد هذا البروتوكول على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن آفات إزالة الميالين المجهرية في دماغ الفأر البالغ لدراسة الخصائص الدبقية الدقيقة في الجسم الحي. توفر هذه التقنية الوقت ولها متطلبات أقل لكل من المجربين والمعدات. تساعد هذه الطريقة على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن دماغ الحيوان ، وخاصة تلك الأنسجة المجهرية في حالات مرضية مختلفة.
ابدأ بالتشريح المجهري للآفات الموسومة بصبغة محايدة حول الجسم الثفني تحت المجهر المجسم. الطرد المركزي للأنسجة المشرطة في 300 مرة غرام لمدة 30 ثانية لجمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب. مزيج إنزيم التسخين المسبق واحد ومزيج الإنزيم من اثنين إلى 37 درجة مئوية في حاضنة.
ثم ، أضف 1،950 ميكرولتر من الإنزيم المسخن مسبقا ، وامزج عينة واحدة إلى عينة واحدة ، وهضمها في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أضف 30 ميكرولتر من الإنزيم المسخن مسبقا ، واخلطه بلطف. بعد الهضم ، أضف أربعة ملليلترات من PBS البارد إلى الأنبوب ، ورجه بلطف.
الطرد المركزي لعينات الأنسجة في 300 مرة غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وشفط supernatant ببطء وبشكل كامل. أعد تعليق حبيبات الخلية بلطف باستخدام 1،550 ميكرولتر من PBS الباردة. أضف 450 ميكرولتر من المحلول البارد لإزالة الحطام ، واخلطها جيدا.
استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتراكب الخليط ببطء شديد ، وبلطف مع ملليلتر من PBS الباردة. الطرد المركزي للخليط ، ثم ابحث عن الطبقات الثلاث. استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لشفط الطبقتين العلويتين بالكامل ، واملأ الأنبوب حتى خمسة ملليلترات بمخزن مؤقت للتحميل البارد.
قلب الأنبوب بلطف ثلاث مرات. بعد ذلك ، بعد الطرد المركزي وشفط supernatant ، أعد تعليق بيليه الخلية مع 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل ، وأضف 10 ميكرولترات من حبات CD11b. تخلط جيدا ، وتحضن لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة ، أضف ملليلتر واحد من مخزن التحميل المؤقت ، واغسل الخلايا عن طريق سحب السائل بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. الطرد المركزي للخلايا في 300 مرة غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وشفط supernatant تماما لإزالة الخرز غير المقيد. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت ، وضع عمود MS مع الفاصل الخاص به للاختيار الإيجابي في المجال المغناطيسي.
شطف العمود مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل لحماية الخلايا وضمان كفاءة الفرز المغناطيسي على أساس بروتوكول الشركة المصنعة. قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود MS ، وتخلص من التدفق الذي يحتوي على الخلايا غير المسماة. أضف 500 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت لغسل العمود وإزالته من الفاصل.
ضع العمود على أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر، وأضف ملليلتر واحد من مخزن التحميل المؤقت إلى العمود. أخيرا ، ادفع المكبس إلى أسفل العمود لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا. يظهر هنا تمثيل تخطيطي لاستراتيجية البوابة المستخدمة في تحليل التدفق الخلوي للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من آفات إزالة الميالين للفئران البالغة قبل وبعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا.
تمثل الصور الرسومية ارتفاع التشتت الأمامي وارتفاع التشتت الجانبي لاختيار الخلايا ومنطقة التشتت الأمامي وارتفاع التشتت الأمامي لاختيار الخلايا المفردة وCD11b-FITC وCD45-APC لاختيار الخلايا النخاعية والخلايا الدبقية الصغيرة. زادت نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل كبير بعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا. تمثل الصورة الرسومية استراتيجية البوابة المستخدمة في تحليل التدفق الخلوي للخلايا المفردة الحية والميتة بعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا.
هنا ، تم استخدام 7-aminoactinomycin D وارتفاع التشتت الجانبي لاختيار الخلايا الحية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر تشريح الآفات المزيلة للميالين بدقة تحت المجهر المجسم بناء على العلامات الحمراء المحايدة.
