이 프로토콜은 생체 내에서 미세아교세포 특성을 연구하기 위해 성인 마우스 뇌의 미세해부된 탈수초화 병변으로부터 미세아교세포를 분리하는 것을 돕는다. 이 기술은 시간을 절약하고 실험자와 장비 모두에 대한 요구 사항이 낮습니다. 이 방법은 미세 아교세포를 동물의 뇌, 특히 다양한 질병 상태의 미세 해부 된 조직에서 분리하는 데 도움이됩니다.
먼저 코퍼스 캘로섬 주위의 중성 염료로 표지된 병변을 입체현미경으로 미세해부한다. 해부된 조직을 30초 동안 300회 g에서 원심분리하여 튜브의 바닥에서 샘플을 수집한다. 예열 효소 하나를 혼합하고 효소는 인큐베이터에서 섭씨 37도까지 두 개를 섞습니다.
그런 다음 1, 950 마이크로 리터의 예열 된 효소를 첨가하여 1 ~ 1 개의 샘플을 혼합하고 섭씨 37 도의 인큐베이터에서 5 분 동안 소화하십시오. 30 마이크로 리터의 예열 된 효소 믹스 두 개를 넣고 부드럽게 섞으십시오. 소화 후, 튜브에 차가운 PBS 네 밀리리터를 넣고 부드럽게 흔들어주십시오.
조직 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 g로 원심분리하고, 상층액을 천천히 그리고 완전히 흡인한다. 세포 펠릿을 1, 550 마이크로리터의 차가운 PBS로 부드럽게 재현탁시킨다. 파편 제거를 위해 차가운 용액 450 마이크로 리터를 넣고 잘 섞으십시오.
1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 혼합물을 매우 천천히 그리고 두 밀리리터의 차가운 PBS로 부드럽게 오버레이하십시오. 혼합물을 원심분리하고, 이어서 세 층을 찾는다. 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 두 개의 최상층을 완전히 흡인하고 냉간 로딩 버퍼로 튜브를 최대 다섯 밀리리터까지 채 웁니다.
튜브를 세 번 부드럽게 뒤집습니다. 다음에, 원심분리 및 상청액의 흡인 후, 세포 펠릿을 90 마이크로리터의 로딩 완충액으로 재현탁시키고, 10 마이크로리터의 CD11b 비드를 첨가한다. 잘 섞어서 섭씨 네 도에서 15 분 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, 로딩 버퍼 1밀리리터를 첨가하고, 1, 000-마이크로리터 피펫으로 액체를 위아래로 부드럽게 피펫팅함으로써 세포를 세척한다. 세포를 섭씨 네 도에서 10분 동안 300배 g에서 원심분리하고, 상층액을 완전히 흡인하여 결합되지 않은 비드를 제거하였다. 세포를 로딩 버퍼의 500 마이크로리터에 재현탁시키고, 자기장에 양성 선택을 위해 그의 분리기와 함께 MS 컬럼을 배치한다.
500 마이크로 리터의 로딩 버퍼로 컬럼을 헹구어 세포를 보호하고 제조업체의 프로토콜에 따라 자기 분류의 효율성을 보장하십시오. 세포 현탁액을 MS 컬럼 상에 적용하고, 표지되지 않은 세포를 함유하는 유동 관통을 폐기한다. 로딩 버퍼 500 마이크로리터를 첨가하여 컬럼을 세척하고, 분리기에서 제거한다.
컬럼을 15밀리리터 원심분리 튜브에 놓고 로딩 버퍼 1밀리리터를 컬럼에 추가합니다. 마지막으로, 플런저를 컬럼의 바닥으로 밀어 자기 표지 된 세포를 플러시하십시오. 자기-활성화 세포 분류 전후의 성인 마우스의 탈수초화 병변으로부터 단리된 미세아교세포의 유세포 분석에 사용된 게이팅 전략의 개략적인 표현이 여기에 제시되어 있다.
그래픽 이미지는 세포를 선택하기 위한 전방 산란 높이 및 측면 산란 높이, 단일 세포를 선택하기 위한 전방 산란 영역 및 전방 산란 높이, 골수성 세포 및 미세아교세포를 선택하기 위한 CD11b-FITC 및 CD45-APC를 나타낸다. 미세아교세포의 비율은 자기-활성화된 세포 분류 후에 유의하게 증가하였다. 그래픽 이미지는 자기-활성화 세포 분류 후 살아있는 단일 및 죽은 단일 세포에 대한 유세포 분석 분석에 사용된 게이팅 전략을 나타낸다.
여기서, 7-아미노악티노마이신 D 및 측면 산란 높이가 살아있는 세포를 선택하는데 사용되었다. 이 절차를 시도하는 동안 중성 적색 표시를 기반으로 입체 현미경으로 탈수초성 병변을 정확하게 미세 해부하는 것을 잊지 마십시오.
