Этот протокол помогает изолировать микроглию из микродиссеченных демиелинационных поражений мозга взрослой мыши для изучения микроглиальных характеристик in vivo. Этот метод экономит время и имеет более низкие требования как к экспериментаторам, так и к оборудованию. Этот метод помогает изолировать микроглию из мозга животного, особенно тех микроразделенных тканей в различных болезненных состояниях.
Начните с микрорассекции поражений, помеченных нейтральным красителем вокруг мозолистого тела под стереомикроскопом. Центрифугируют рассеченную ткань в 300 раз в г в течение 30 секунд, чтобы собрать образец на дне пробирки. Разогреть фермент смешать один и фермент смешать от двух до 37 градусов Цельсия в инкубаторе.
Затем добавьте 1 950 микролитров предварительно нагретой ферментной смеси один к одному образцу и переварите в инкубаторе при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Добавьте 30 микролитров предварительно разогретого фермента, смешайте два и аккуратно перемешайте. После переваривания добавьте в пробирку четыре миллилитра холодного PBS и аккуратно встряхните.
Центрифугируйте образцы тканей в 300 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и медленно и полностью аспирируйте супернатант. Аккуратно повторно суспендируйте гранулу ячейки с помощью 1 550 микролитров холодного PBS. Добавьте 450 микролитров холодного раствора для удаления мусора и хорошо перемешайте их.
Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы наложить смесь очень медленно и осторожно с двумя миллилитрами холодного PBS. Центрифугируйте смесь, а затем найдите три слоя. Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы полностью аспирировать два верхних слоя, и заполните трубку до пяти миллилитров буфером холодной загрузки.
Аккуратно переверните трубку три раза. Далее, после центрифугирования и аспирации надосадочного вещества, повторно суспендируют ячейку гранулы с 90 микролитрами нагрузочного буфера и добавляют 10 микролитров ШАРИКОВ CD11b. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
После инкубации добавьте один миллилитр нагрузочного буфера и промыть клетки, осторожно пипетируя жидкость вверх и вниз пипеткой объемом 1000 микролитров. Центрифугируйте клетки в 300 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и полностью аспирируйте супернатант, чтобы удалить несвязанные шарики. Повторно суспендируйте ячейки в 500 микролитрах нагрузочного буфера и поместите колонну MS с ее сепаратором для положительного отбора в магнитном поле.
Промыть колонну 500 микролитрами загрузочного буфера для защиты ячеек и обеспечения эффективности магнитной сортировки на основе протокола производителя. Нанесите суспензию ячейки на столбец MS и отбросьте сквозной поток, содержащий непомеченные ячейки. Добавьте 500 микролитров загрузочного буфера для промывки колонны и извлеките ее из сепаратора.
Поместите колонну на 15-миллилитровую центрифужную трубку и добавьте в колонну один миллилитр нагрузочного буфера. Наконец, подтолкните плунжер к нижней части колонны, чтобы смыть магнитно меченые ячейки. Здесь показано схематическое представление стратегии гатинга, используемой при анализе проточной цитометрии микроглии, выделенной из демиелинизационных поражений взрослых мышей до и после магнитно-активированной сортировки клеток.
Графические изображения представляют высоту прямого рассеяния и высоту бокового рассеяния для выбора ячеек, область прямого рассеяния и высоту прямого рассеяния для выбора отдельных ячеек, а также CD11b-FITC и CD45-APC для выбора миелоидных клеток и микроглии. Доля микроглии значительно возросла после магнитно-активированной сортировки клеток. Графическое изображение представляет собой стратегию гастинга, используемую в анализе проточной цитометрии для живых и мертвых одиночных клеток после магнитно-активированной сортировки клеток.
Здесь 7-аминоактиномицин D и высота бокового рассеяния были использованы для отбора живых клеток. При попытке этой процедуры не забудьте точно микродизировать демиелинизирующие поражения под стереомикроскопом на основе нейтральных красных отметин.
