このプロトコールは、成体マウス脳の微小解剖脱髄病変からミクログリアを単離し、インビボでのミクログリア特性を研究するのに役立つ。この技術は時間を節約し、実験者と機器の両方にとってより低い要件を持っています。この方法は、動物の脳、特に様々な疾患状態の微小解剖組織からミクログリアを単離するのに役立つ。
まず、脳梁の周囲の中性色素によって標識された病変を実体顕微鏡下で微小解剖することから始める。解剖した組織を300倍gで30秒間遠心分離し、チューブの底部でサンプルを回収した。インキュベーター内で酵素ミックス1つと酵素ミックス2つを摂氏37度に予熱します。
次いで、1,950マイクロリットルの予熱酵素を加え、1対1のサンプルを混合し、摂氏37度のインキュベーターで5分間消化する。予熱した酵素ミックス2種を30マイクロリットル加え、穏やかに混合する。消化後、4ミリリットルの冷たいPBSをチューブに加え、静かに振る。
組織サンプルを300倍gで4°Cで10分間遠心分離し、上清をゆっくりと完全に吸引する。細胞ペレットを1,550マイクロリットルの冷たいPBSで穏やかに再懸濁する。破片除去のために450マイクロリットルの冷たい溶液を加え、それらをよく混ぜる。
1,000マイクロリットルのピペットを使用して、混合物を非常にゆっくりと、そして2ミリリットルの冷たいPBSで穏やかに重ねます。混合物を遠心分離し、3つの層を探す。1,000マイクロリットルのピペットを使用して最上層2本を完全に吸引し、チューブを最大5ミリリットルのコールドローディングバッファーで満たします。
チューブを3回静かに反転させます。次に、遠心分離および上清の吸引後、細胞ペレットを90マイクロリットルのローディングバッファーで再懸濁し、10マイクロリットルのCD11bビーズを加える。よく混ぜ、摂氏4度で15分間インキュベートします。
インキュベーション後、1ミリリットルのローディングバッファーを加え、1,000マイクロリットルのピペットで液体を上下に穏やかにピペッティングして細胞を洗浄します。細胞を摂氏4度で10分間、300倍gで遠心分離し、上清を完全に吸引して未結合ビーズを除去した。細胞を500マイクロリットルのローディングバッファーに再懸濁し、MSカラムとその分離器を磁場中に正の選択のために置きます。
カラムを 500 マイクロリットルのローディングバッファーですすぎ、細胞を保護し、メーカーのプロトコルに基づく磁気選別効率を確保します。細胞懸濁液をMSカラムに塗布し、非標識細胞を含むフロースルーを破棄する。500マイクロリットルのローディングバッファーを加えてカラムを洗浄し、分離器から取り出します。
カラムを 15 ミリリットルの遠沈管に置き、1 ミリリットルのローディングバッファーをカラムに加えます。最後に、プランジャーをカラムの底部に押し込んで、磁気標識された細胞を洗い流します。磁気活性化細胞選別の前後の成体マウスの脱髄病変から単離されたミクログリアのフローサイトメトリー分析において使用されるゲーティング戦略の概略図がここに示されている。
グラフィカル画像は、細胞を選択するための前方散乱高さおよび側方散乱高さ、単一細胞を選択するための前方散乱面積および前方散乱高さ、ならびに骨髄系細胞およびミクログリアを選択するためのCD11b−FITCおよびCD45−APCを表す。ミクログリアの割合は、磁気活性化細胞選別後に有意に増加した。グラフィカルな画像は、磁気活性化細胞選別後の生細胞および死細胞のフローサイトメトリー分析で使用されるゲーティング戦略を表しています。
ここで、7-アミノアクチノマイシンD及び側方散乱高さは、生細胞を選択するために用いられている。この手順を試みている間は、中性赤色のマーキングに基づいて実体顕微鏡下で脱髄病変を正確に微小解剖することを忘れないでください。
