Göçmen çekirge önemli bir tarımsal testtir. Bu yöntem, gen basıncı yöntemleri için etkili ve kolay bir verim protokolü sağlar. Homozigot çekirge mutantlarının CRISPR / CAS9 yapımının, yumurta toplama, mutant taraması ve homozigot bakımı dahil olmak üzere sistematik ve ayrıntılı bir yöntemidir. Başlamak için, cam kılcal damarları bir mikro pipet çektirici ile çekerek enjeksiyon iğnelerini hazırlayın.
Parametreleri metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın, ardından enjeksiyon iğnesinin ucunu bir mikro öğütücü ile öğütün. Bir mikrolitre Cas9 proteinini doğrulanmış tek kılavuz RNA'nın bir mikrolitresi ile karıştırarak enjeksiyon için ribonükleo proteini hazırlayın. Ardından, karışımın son hacmini 10 mikrolitre yapmak için sekiz mikrolitre RNA'nın serbest steril suyunu ekleyin.
Çözeltiyi iyice karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin. Ardından, taze serilmiş yumurta kabuklarını ova pozisyon kabuğundan toplayın ve yumurta bronzlaşmasını bekleyin. 30 dakika sonra, yumurtaları yumurta kabuklarından suda izole etmek için ince bir fırça kullanın ve yumurtaları steril suyla üç kez yıkayın.
Sonra yumurtaları bir Petri kabına koyun ve nemli tutmak için steril su ekleyin. Enjeksiyon iğnesini hazırlanan ribonükleo protein çözeltisi ile doldurun ve enjeksiyonu mikro manipülatöre yükleyin. Mikroenjeksiyon parametrelerini 300 Hektopaskal enjeksiyon basıncı, 0,5 saniye enjeksiyon süresi ve 25 Hektopaskal kompanzasyon basıncı olarak ayarlayın.
Parametreler ayarlandığında, enjekte edilen çözeltinin hacmini değerlendirmek için pedala basın. Enjeksiyon hacminin yaklaşık 50 ila 100 nanolitre olmasını sağlamak için enjeksiyon basıncını ve enjeksiyon süresini ayarlayın. Steril yumurtaları enjeksiyon pedi üzerine düzenli olarak yerleştirdikten sonra, pedi mikroskobun nesne masasına yerleştirin ve yumurtalar gözlenene kadar mikroskobun büyütmesini ayarlayın.
Daha sonra mikroenjeksiyon iğnesini, enjeksiyon ucu görülene kadar mikroskop altında ayarlayın ve ucu enjekte edilecek yumurtanın yanına yerleştirin. Enjeksiyonu uygun bir yükseklikte ve 30 ila 45 derecelik bir açıyla başlatın. Ucu yumurtanın mikro yığınlarının yakınındaki yumurtaya yerleştirin ve enjeksiyonu gerçekleştirmek için pedala basın.
Ardından, iğneyi hızlı bir şekilde geri çekin ve bir sonraki yumurtanın enjeksiyonu için enjeksiyon pedini hareket ettirin. Enjekte edilen yumurtaları bir parça nemli filtre kağıdı ile bir kültür kabına aktarın. Onları 30 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.
Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen yumurtaların gelişimini her gün kontrol edin. Enjekte edilen yumurtaları ilk beş günde her 24 saatte bir yeni bir kültür kabına aktarın. Enjeksiyondan sonraki altıncı günde, rastgele 10 yumurta toplayıp bir tüpe aktarın ve yumurtaları bir öğütücü kullanarak altı dakika boyunca 60 hertz'de iki çelik bilyeyle yeterince öğütün.
Taşlamadan sonra, kalıntıları bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra, askıya alınmış karışımın beş mikrolitresini, beş dakika boyunca 95 santigrat derecede lize etmek için 45 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit içine aktarın. Alkali lizis reaksiyonunu sonlandırmak için, lizis sistemine beş mikrolitre bir molar Tris hidroklorür çözeltisi ekleyin.
Hedef gen parçasını büyütmek için PCR şablonu olarak lizis ürününün bir mikrolitresini alın. PCR ve dizilemeden sonra, CRISPR / Cas9 sisteminin hedef geni in vivo olarak parçalayıp parçalamadığını değerlendirmek için dizileme sonuçlarını vahşi tip dizilimiyle karşılaştırın. Embriyonik aşamada indeller tespit edildiğinden, yumurtaların geri kalanının daha sonraki gelişim için kullanılmasına izin verin.
Gelişim, transfer ve kültürden sonra, yumurtadan çıkan nimfler el yazmasında açıklandığı gibi bir yetiştirme kafesine girer. Perileri beşinci instar aşamasına geldiğinde, onları plastik kültür kaplarıyla ayırın. G0 mutantlarını ve vahşi tip çekirgeleri kullanarak melezleme yapın.
Oassistleri topladıktan sonra, daha önce tarif edildiği gibi mutasyonları tespit etmek için her bir oassistte üç ila altı gelişmiş yumurta kullanın. Sonraki gelişim için mutasyon pozitif oassistleri tutun ve mutasyon negatif oassistleri terk edin. Kriyo-koruma için, yumurtaları steril suyla yıkayın ve daha önce açıklandığı gibi bir kültür kabında inkübe edin.
Beş ila altı gün sonra, yumurtaları kültür kabında bir araya getirin ve filtre kağıdı parçalarıyla örtün. Sonra tüm kültür yemeğini bir parafin filmle sarın. Çanağı iki gün boyunca 25 santigrat dereceye yerleştirin, ardından iki gün daha 13 ila 16 santigrat derece daha düşük bir sıcaklıkta yerleştirin.
Ardından tabağı altı santigrat derecelik bir buzdolabına aktarın. Yumurtalar için nemli bir ortam sağlamak için her iki haftada bir yemeğe su ekleyin. Son olarak, kriyokorunmuş yumurtaları canlandırmak için, Petri kabını iki gün boyunca 25 santigrat dereceye yerleştirin.
Daha sonra, nimfler yumurtadan çıkana kadar yumurtaları 30 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bu çalışmada, CRISPR / Cas9 sistemi için hedef bölge ilk ekzonda yer almıştır. Cas9 bölünme tahlilinde, CRISPR / Cas9 ribonükleo proteini, hedef bölgeyi içeren PCR fragmanını yaklaşık% 55'lik bir bölünme oranıyla sindirebilirEmbriyonik evre mutasyon oranı tahmini için dizileme sonuçları, hedef bölgede etkili genom düzenlemesi önerdi.
Düzenleme verimliliği% 52.73'lük bir nimf kuluçka oranı ile sonuçlandı ve G0 yetişkinlerinin% 66.67'si mozaik mutantlarıydı. Mutant çizgilerin geçiş stratejisi burada gösterilmektedir. Fazla homozigot yumurtalar, homozigotların kullanım oranını artırmak için kriyokorunmuştur.
Kriyoprezervasyon süresinin uzaması ile kriyokorunmuş yumurtaların kuluçka hızı azalmış olsa da, filtre kağıdı parçalarının uygulanması ve bu korunmuş yumurtaların yükselen sıcaklık gradyanı ile geri kazanılması gibi iyileştirici eylemler resüsitasyon için yardımcı olmuştur. En önemli şey, mikroenjeksiyonun neden olduğu mekanik hasarı sınırlamaya çalışmaktır. Bu prosedür, diğer böceklere ulaşmak için bir referans olarak kullanılabilir.
Yumurta toplama, enjeksiyon ve mahsul yöntemleri gibi bazı detayların bir kısmı değiştirilmelidir. Bu teknik aynı zamanda metamorfozu incelemek için de yararlı olabilir ve böceklerin çevresel adaptasyonu ve homozigot çekirge mutantlarının inşası bu alandaki araştırmaları hızlandırdı.
