철새 메뚜기는 중요한 농업 시험입니다. 이 방법은 난자 수집, 돌연변이 스크리닝 및 동형접합체 유지를 포함하는 동형접합체 메뚜기 돌연변이체의 CRISPR/CAS9 구성의 체계적이고 상세한 방법인 유전자 압력 방법에 대한 효율적이고 수율이 쉬운 프로토콜을 제공합니다. 시작하려면 마이크로 피펫 풀러로 유리 모세관을 당겨 주사 바늘을 준비합니다.
텍스트 원고에 설명 된대로 매개 변수를 설정 한 다음 마이크로 그라인더로 주사 바늘 끝을 연마하십시오. 1마이크로리터의 Cas9 단백질과 1마이크로리터의 검증된 단일 가이드 RNA를 혼합하여 주입용 리보핵체 단백질을 준비합니다. 그런 다음 8 마이크로 리터의 RNA의 유리 멸균수를 추가하여 혼합물의 최종 부피 인 10 마이크로 리터를 만듭니다.
용액을 철저히 섞어 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 난자 위치 꼬투리에서 갓 낳은 달걀 꼬투리를 모으고 달걀 태닝을 기다립니다. 30분 후 가는 솔을 사용하여 물에 있는 달걀 꼬투리에서 달걀을 분리하고 멸균수로 달걀을 세 번 씻습니다.
그런 다음 계란을 페트리 접시에 넣고 멸균수를 추가하여 촉촉하게 유지하십시오. 준비된 리보뉴클레오 단백질 용액으로 주사 바늘을 채우고 주사액을 마이크로 매니퓰레이터에 로드합니다. 미세주입 파라미터를 300헥토파스칼의 주입 압력, 0.5초의 주입 시간 및 25헥토파스칼의 보정 압력으로 설정합니다.
매개변수가 설정되면 페달을 밟아 주입된 용액의 부피를 평가합니다. 주입 압력과 주입 시간을 조정하여 주입 부피가 약 50-100 나노 리터가되도록하십시오. 멸균 계란을 주입 패드에 규칙적으로 배열한 후 패드를 현미경의 물체 테이블에 놓고 계란이 관찰될 때까지 현미경의 배율을 조정합니다.
그런 다음 주입 팁이 보일 때까지 현미경으로 미세 주입 바늘을 조정하고 주입할 계란 근처에 팁을 배치합니다. 적절한 높이와 30-45도 각도로 주입을 시작하십시오. 달걀의 마이크로 더미 근처의 달걀에 팁을 삽입하고 페달을 밟아 주입을 완료합니다.
그런 다음 바늘을 빠르게 집어넣고 다음 계란을 주입하기 위해 주입 패드를 움직입니다. 주입 된 계란을 촉촉한 여과지로 배양 접시에 옮깁니다. 섭씨 30도의 인큐베이터에 넣습니다.
주사 후 매일 주입 된 난자의 발달을 확인하십시오. 처음 5 일 동안 24 시간마다 주입 된 계란을 새로운 배양 접시로 옮깁니다. 주사 후 6 일째에 무작위로 10 개의 알을 골라 튜브에 옮기고 그라인더를 사용하여 6 분 동안 60 헤르츠에서 두 개의 강철 볼로 알을 적절하게 분쇄합니다.
분쇄 후 파편을 1 밀리리터 PBS에 재현 탁하십시오. 그런 다음 5 마이크로 리터의 재현 탁 된 혼합물을 45 마이크로 리터의 50 밀리몰 수산화 나트륨으로 옮겨 섭씨 95도에서 5 분 동안 용해시킵니다. 알칼리 용해 반응을 종결하려면 5 마이크로 리터의 1 몰 트리스 염산염 용액을 용해 시스템에 첨가하십시오.
용해 산물 1마이크로리터를 PCR 주형으로 사용하여 표적 유전자 단편을 증폭합니다. PCR 및 염기서열분석 후 염기서열 분석 결과를 야생형 염기서열과 비교하여 CRISPR/Cas9 system이 in vivo에서 표적 유전자를 절단했는지 여부를 평가합니다. 배아 단계에서 indels가 감지되므로 후속 발달을 위해 나머지 난자를 허용합니다.
발달 후, 부화 한 님프를 원고에 설명 된대로 사육장으로 옮기고 배양하십시오. 님프가 다섯 번째 instar 단계로 발전하면 플라스틱 배양 컵으로 분리하십시오. G0 돌연변이와 야생형 메뚜기를 사용하여 교배를 수행합니다.
오어시스트를 채취한 후, 각 오어시스트에 3-6개의 발달된 알을 사용하여 앞서 설명한 대로 돌연변이를 감지합니다. 후속 개발을 위해 돌연변이 양성 오어시스트를 유지하고 돌연변이 음성 오어시스트를 포기하십시오. 냉동 보존을 위해 계란을 멸균수로 씻고 앞서 설명한 대로 배양 접시에 담습니다.
5-6 일 후, 배양 접시에 알을 모으고 여과지 조각으로 덮으십시오. 그런 다음 전체 배양 접시를 파라핀 필름으로 감싼다. 접시를 섭씨 25도에서 이틀 동안 놓은 다음 섭씨 13도에서 16도 사이의 낮은 온도에서 이틀 더 놓습니다.
그런 다음 접시를 섭씨 6도 냉장고로 옮깁니다. 계란에 촉촉한 환경을 제공하기 위해 2주마다 접시에 물을 추가합니다. 마지막으로 냉동보존된 계란을 소생시키기 위해 페트리 접시를 섭씨 25도에서 이틀 동안 두십시오.
나중에 님프가 부화 할 때까지 섭씨 30도 인큐베이터에 알을 넣으십시오. 이 연구에서 CRISPR/Cas9 시스템의 표적 부위는 첫 번째 엑손에 위치했습니다. Cas9 cleavage assay에서 CRISPR/Cas9 ribonucleo 단백질은 약 55%의 절단률로 표적 부위를 포함하는 PCR 단편을 분해할 수 있었으며, 배아 단계 돌연변이율 추정을 위한 염기서열 분석 결과는 표적 부위에서 효율적인 게놈 편집을 시사했습니다.
편집 효율은 52.73%의 님프 부화율을 가져왔고 G0 성체의 66.67%가 모자이크 돌연변이였습니다. 돌연변이 라인의 패시징 전략은 다음과 같습니다. 과잉 동형접합 난자는 동형접합체의 이용률을 향상시키기 위해 냉동보존되었습니다.
냉동보존기간이 연장됨에 따라 냉동보존란의 부화율이 감소하였지만, 여과지 파편을 도포하고 이러한 보존된 알을 온도 상승의 구배로 회수하는 등의 교정 조치가 소생에 도움이 되었습니다. 가장 중요한 것은 미세 주입으로 인한 기계적 손상을 제한하는 것입니다. 이 절차는 다른 곤충을 얻기 위한 참고 자료로 사용할 수 있습니다.
계란 수집, 주입 및 작물 방법과 같은 일부 세부 사항의 일부를 수정해야합니다. 이 기술은 또한 변태와 곤충의 환경 적응을 연구하는 데 도움이 될 수 있으며 동형 접합 메뚜기 돌연변이의 구성은이 분야의 연구를 가속화했습니다.
