O gafanhoto migratório é um importante teste agrícola. Este método fornece um protocolo eficiente e de fácil produção para os métodos de pressão gênica do É um método sistemático e detalhado de uma construção CRISPR/CAS9 de mutantes homozigotos de gafanhotos, incluindo coleta de ovos, triagem de mutantes e manutenção de homozigotos. Para começar, prepare as agulhas de injeção puxando os capilares de vidro com um puxador de micropipeta.
Defina os parâmetros conforme descrito no manuscrito de texto e, em seguida, triture a ponta da agulha de injeção com um micromoedor. Preparar a proteína ribonucleo para a injeção misturando um microlitro de proteína Cas9 com um microlitro do RNA guia único verificado. Em seguida, adicione oito microlitros de água estéril livre de RNA para fazer o volume final da mistura, 10 microlitros.
Misture bem a solução e coloque-a no gelo. Em seguida, colete as vagens de ovos recém-colocadas da vagem de posição ova e aguarde o bronzeamento dos ovos. Após 30 minutos, use uma escova fina para isolar os ovos das vagens de ovos em água e lave os ovos três vezes com água estéril.
Em seguida, coloque os ovos em uma placa de Petri e adicione água estéril para mantê-los úmidos. Encha a agulha de injeção com a solução preparada de proteína ribonucleo e carregue a injeção no micromanipulador. Defina os parâmetros de microinjeção como 300 Hectopascals de pressão de injeção, 0,5 segundos de tempo de injeção e 25 Hectopascals de pressão de compensação.
Quando os parâmetros estiverem definidos, pressione o pedal para avaliar o volume da solução injetada. Ajuste a pressão de injeção e o tempo de injeção para garantir que o volume de injeção seja de cerca de 50 a 100 nanolitros. Depois de organizar os ovos estéreis regularmente na almofada de injeção, coloque a almofada na mesa de objetos do microscópio e ajuste a ampliação do microscópio até que os ovos sejam observados.
Em seguida, ajuste a agulha de microinjeção sob o microscópio até que a ponta de injeção possa ser vista e posicione a ponta perto do ovo a ser injetado. Inicie a injeção a uma altura adequada e num ângulo de 30 a 45 graus. Insira a ponta no ovo perto das micro pilhas do ovo e pressione o pedal para realizar a injeção.
Em seguida, retraia a agulha rapidamente e mova a almofada de injeção para injeção do próximo ovo. Transfira os ovos injetados para uma placa de cultura com um pedaço de papel de filtro úmido. Coloque-os em uma incubadora a 30 graus Celsius.
Após a injeção, verifique o desenvolvimento dos ovos injetados todos os dias. Transfira os ovos injetados para uma nova placa de cultura a cada 24 horas nos primeiros cinco dias. No sexto dia após a injeção, colher e transferir aleatoriamente 10 ovos para um tubo e triturar adequadamente os ovos com duas esferas de aço a 60 hertz por seis minutos usando um moedor.
Após a trituração, ressuspenda os detritos em um mililitro PBS. Em seguida, transfira cinco microlitros da mistura ressuspensa em 45 microlitros de hidróxido de sódio de 50 milimolares para lisar a 95 graus Celsius por cinco minutos. Para terminar a reação de lise alcalina, adicione cinco microlitros de uma solução molar de cloridrato de Tris no sistema de lise.
Tome um microlitro do produto de lise como o molde de PCR para amplificar o fragmento do gene alvo. Após a PCR e o sequenciamento, comparar os resultados do sequenciamento com a sequência selvagem para avaliar se o sistema CRISPR/Cas9 clivou o gene alvo in vivo. Permitir o resto dos ovos para o desenvolvimento subsequente, pois indels são detectados na fase embrionária.
Após o desenvolvimento, transferência e cultura, as ninfas eclodiram em uma gaiola de criação, conforme descrito no manuscrito. Quando as ninfas se desenvolverem até o estágio de quinto ínstar, separe-as com copos de cultura de plástico. Realizar cruzamentos usando os mutantes G0 e gafanhotos selvagens.
Depois de coletar oassists, use três a seis ovos desenvolvidos em cada oassist para detectar mutações como descrito anteriormente. Mantenha oassists positivos para o desenvolvimento subsequente e abandone os oassists negativos de mutação. Para criopreservação, lave os ovos com água estéril e incube-os em uma placa de cultura como explicado anteriormente.
Após cinco a seis dias, junte os ovos na placa de cultura e cubra-os com fragmentos de papel filtro. Em seguida, envolva todo o prato de cultura com um filme de parafina. Coloque o prato a 25 graus Celsius por dois dias, seguidos por mais dois dias a uma temperatura mais baixa de 13 a 16 graus Celsius.
Em seguida, transfira o prato para uma geladeira de seis graus Celsius. Adicione água ao prato a cada duas semanas para proporcionar um ambiente úmido para os ovos. Finalmente, para ressuscitar os ovos criopreservados, coloque a placa de Petri a 25 graus Celsius por dois dias.
Mais tarde, coloque os ovos em uma incubadora de 30 graus Celsius até que as ninfas eclodam. Neste estudo, o local alvo do sistema CRISPR/Cas9 foi localizado no primeiro éxon. No ensaio de clivagem de Cas9, a proteína ribonucleo CRISPR/Cas9 pôde digerir o fragmento de PCR contendo o sítio alvo com uma taxa de clivagem de cerca de 55%Os resultados do sequenciamento para a estimativa da taxa de mutação em estágio embrionário sugeriram edição eficiente do genoma no local alvo.
A eficiência de edição resultou em uma taxa de eclosão de 52,73% de ninfas e 66,67% dos adultos G0 eram mutantes em mosaico. A estratégia de passagem das linhas mutantes é mostrada aqui. O excesso de ovos homozigotos foi criopreservados para melhorar a taxa de utilização dos homozigotos.
Embora a taxa de eclosão dos ovos criopreservados tenha sido reduzida com a extensão do tempo de criopreservação, as ações corretivas, como a aplicação de fragmentos de papel de filtro e a recuperação desses ovos preservados com um gradiente de elevação de temperatura, foram úteis para a ressuscitação. O mais importante é tentar limitar os danos mecânicos causados pela microinjeção. Este procedimento pode ser utilizado como referência para a obtenção de outros insetos.
Parte de alguns detalhes como métodos de coleta de ovos, injeção e a cultura devem ser modificados. Esta técnica também pode ser útil para estudar metamorfoses e a adaptação ambiental dos insetos e a construção de mutantes homozigotos de gafanhotos acelerou a pesquisa neste campo.
