Die Wanderheuschrecke ist ein wichtiger landwirtschaftlicher Test. Es handelt sich um eine systematische und detaillierte Methode der CRISPR/CAS9-Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten, einschließlich der Eizellentnahme, des Mutantenscreenings und der homozygoten Erhaltung. Bereiten Sie zunächst die Injektionsnadeln vor, indem Sie die Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher ziehen.
Stellen Sie die Parameter wie im Textmanuskript beschrieben ein und schleifen Sie dann die Spitze der Injektionsnadel mit einem Mikroschleifer. Bereiten Sie das Ribonukleoprotein für die Injektion vor, indem Sie einen Mikroliter Cas9-Protein mit einem Mikroliter der verifizierten Einzelleit-RNA mischen. Fügen Sie dann acht Mikroliter des kostenlosen sterilen Wassers der RNA hinzu, um das endgültige Volumen der Mischung zu erhalten, 10 Mikroliter.
Mischen Sie die Lösung gründlich und legen Sie sie auf Eis. Sammeln Sie als Nächstes die frisch gelegten Eikapseln aus der Eiablagekapsel und warten Sie, bis die Eier gegerbt sind. Isolieren Sie die Eier nach 30 Minuten mit einer feinen Bürste von den Eierschoten in Wasser und waschen Sie die Eier dreimal mit sterilem Wasser.
Legen Sie dann die Eier in eine Petrischale und fügen Sie steriles Wasser hinzu, um sie feucht zu halten. Füllen Sie die Injektionsnadel mit der vorbereiteten Ribonukleoproteinlösung und laden Sie die Injektion in den Mikromanipulator. Stellen Sie die Mikroinjektionsparameter auf 300 Hektopascal Einspritzdruck, 0,5 Sekunden Einspritzzeit und 25 Hektopascal Ausgleichsdruck ein.
Wenn die Parameter eingestellt sind, drücken Sie das Pedal, um das Volumen der injizierten Lösung zu bewerten. Stellen Sie den Einspritzdruck und die Einspritzzeit so ein, dass das Einspritzvolumen etwa 50 bis 100 Nanoliter beträgt. Nachdem Sie die sterilen Eizellen regelmäßig auf dem Injektionskissen angeordnet haben, legen Sie das Pad auf den Objekttisch des Mikroskops und stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops ein, bis die Eier beobachtet werden.
Stellen Sie dann die Mikroinjektionsnadel unter dem Mikroskop ein, bis die Injektionsspitze zu sehen ist, und positionieren Sie die Spitze in der Nähe der zu injizierenden Eizelle. Beginnen Sie die Injektion in einer geeigneten Höhe und einem Winkel von 30 bis 45 Grad. Führen Sie die Spitze in der Nähe der Mikrohaufen des Eies in das Ei ein und drücken Sie das Pedal, um die Injektion durchzuführen.
Ziehen Sie dann die Nadel schnell zurück und bewegen Sie das Injektionskissen für die Injektion der nächsten Eizelle. Übertragen Sie die injizierten Eier in eine Kulturschale mit einem Stück feuchtem Filterpapier. Legen Sie sie in einen Inkubator bei 30 Grad Celsius.
Kontrollieren Sie nach der Injektion täglich die Entwicklung der injizierten Eizellen. Übertragen Sie die injizierten Eizellen in den ersten fünf Tagen alle 24 Stunden in eine neue Kulturschale. Am sechsten Tag nach der Injektion werden nach dem Zufallsprinzip 10 Eizellen entnommen und in ein Röhrchen übertragen und die Eizellen mit zwei Stahlkugeln bei 60 Hertz sechs Minuten lang mit einer Mühle ausreichend zerkleinert.
Nach dem Mahlen resuspendieren Sie den Schmutz in einem Milliliter PBS. Dann werden fünf Mikroliter des resuspendierten Gemisches in 45 Mikroliter 50 millimolare Natronlauge überführt, um fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius zu lysieren. Um die alkalische Lysereaktion zu beenden, werden fünf Mikroliter einer molaren Trishydrochloridlösung in das Lysesystem gegeben.
Nehmen Sie einen Mikroliter des Lyseprodukts als PCR-Template, um das Zielgenfragment zu amplifizieren. Vergleichen Sie nach der PCR und Sequenzierung die Sequenzierungsergebnisse mit der Wildtyp-Sequenz, um zu beurteilen, ob das CRISPR/Cas9-System das Zielgen in vivo gespalten hat. Lassen Sie den Rest der Eizellen für die spätere Entwicklung stehen, da Indels im Embryonalstadium nachgewiesen werden.
Nach der Entwicklung, dem Transfer und der Kultivierung der geschlüpften Nymphen in einen Aufzuchtkäfig, wie im Manuskript beschrieben. Wenn sich die Nymphen bis zum fünften Stadium entwickeln, trennen Sie sie mit Plastikkulturbechern. Führen Sie eine Kreuzung mit den G0-Mutanten und Wildtyp-Heuschrecken durch.
Verwenden Sie nach der Entnahme von Oassists drei bis sechs entwickelte Eizellen in jedem Oassist, um Mutationen wie zuvor beschrieben zu erkennen. Bewahren Sie mutationspositive Oassists für die spätere Entwicklung auf und geben Sie die mutationsnegativen Oassists auf. Für die Kryokonservierung waschen Sie die Eier mit sterilem Wasser und inkubieren Sie sie wie zuvor beschrieben in einer Kulturschale.
Nach fünf bis sechs Tagen sammeln Sie die Eier in der Kulturschale und decken sie mit Filterpapierfragmenten ab. Wickeln Sie dann die gesamte Kulturschale mit einer Paraffinfolie ein. Stellen Sie das Gericht zwei Tage lang auf 25 Grad Celsius, gefolgt von weiteren zwei Tagen bei einer niedrigeren Temperatur von 13 bis 16 Grad Celsius.
Dann das Gericht in einen Kühlschrank mit sechs Grad Celsius stellen. Geben Sie alle zwei Wochen Wasser in die Schüssel, um eine feuchte Umgebung für die Eier zu schaffen. Um die kryokonservierten Eier wiederzubeleben, stellen Sie die Petrischale schließlich zwei Tage lang auf 25 Grad Celsius.
Legen Sie die Eier später in einen 30 Grad Celsius heißen Brutkasten, bis die Nymphen schlüpfen. In dieser Studie befand sich die Zielstelle für das CRISPR/Cas9-System im ersten Exon. Im Cas9-Spaltungsassay konnte das CRISPR/Cas9-Ribonukleoprotein das PCR-Fragment, das die Zielstelle enthielt, mit einer Spaltrate von etwa 55 % verdauen.
Die Editiereffizienz führte zu einer Schlupfrate von 52,73 % der Nymphen und 66,67 % der erwachsenen G0-Tiere waren Mosaikmutanten. Die Passagenstrategie der Mutantenlinien wird hier gezeigt. Die überschüssigen homozygoten Eizellen wurden kryokonserviert, um die Verwertungsrate der Homozygoten zu verbessern.
Obwohl die Schlupfrate der kryokonservierten Eier mit der Verlängerung der Kryokonservierungszeit verringert wurde, waren die Abhilfemaßnahmen wie das Auftragen von Filterpapierfragmenten und die Gewinnung dieser konservierten Eier mit einem Gradienten steigender Temperatur hilfreich für die Wiederbelebung. Das Wichtigste ist, zu versuchen, die mechanischen Schäden durch die Mikroinjektion zu begrenzen. Dieses Verfahren kann als Referenz für das Erreichen anderer Insekten verwendet werden.
Einige Details wie die Methoden der Eizellentnahme, der Injektion und der Ernte sollten geändert werden. Diese Technik kann auch hilfreich sein, um die Metamorphose und die Umweltanpassung der Insekten zu untersuchen, und die Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten beschleunigte die Forschung auf diesem Gebiet.
