Bu protokol, Muller glia'nın mikroRNA'lar gibi spesifik faktörlerle tedaviden sonra retinal progenitör hücrelere dönüşme potansiyelini ve kapasitesini incelemeye izin verir. Bu tekniğin avantajı, mikroRNA adaylarının in vivo uygulamalarda kullanılmadan önce verimlilikleri ve sonuçları açısından test edilebilmeleridir. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak kişi, Stefanie Wohl'un laboratuvarından doktora öğrencisi olan Seoyoung Kang olacak.
İlk olarak, çıkarılan göz küresini, bakterilerin hayvandan taşınmasını önlemek için etanollü bir tüpe kısaca batırın. Ardından, göz küresini buz üzerindeki 24 kuyucuklu plakaya yerleştirmeden önce 10 santimetrelik Petri kabında kısaca yıkayın. Göz küreleri çıkarıldıktan ve temizlendikten sonra, bir gözü bir ışık kaynağı ile diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirilmiş diseksiyon kabına yerleştirin.
Şimdi optik siniri ve skleranın etrafındaki bağ dokusunu Dumont 5 ince forseps ile tutarak bir göz küresini sabitleyin ve diseksiyon kabına dikkatlice bastırın. Daha sonra, venöz makaslara daha kolay erişim sağlamak için 30 gauge iğne kullanarak kornea merkezinde bir delik açın. Daha sonra, venöz makas kullanarak siliyer cismin etrafındaki korneayı diseke edin ve kornea, lens, iris ve vitreus gövdesini Dumont 5 ince forseps ile dikkatlice çıkarın.
Daha sonra optik sinire ulaşılana kadar sklerayı venöz makasla diseke edin ve Dumont 5 ince forseps kullanarak retinayı dikkatlice çıkarın. Şimdi retinaya doğru itmek ve vitreus gövdesini tamamen çıkarmak için ikinci bir Dumont 5 ince forseps kullanın. Retinaların çapı büyütmek için steril bir transfer pipetinin ucunun yaklaşık 2,5 santimetresini keser.
Şimdi bu ucu kullanarak, dokuya zarar vermeden tüm retinaları toplayın ve retinaları soğuk HBSS ile yeni bir steril Petri kabına aktarın ve çanağı sallayın. Daha sonra, yeni bir steril transfer pipeti kullanarak, retinal pigment epitel hücrelerini yıkamak için retinaları dikkatlice itin. İzole edilmiş retinayı derhal bir mililitre HBSS ile doldurulmuş 24 kuyu plakasının yeni bir temiz kuyusuna yerleştirin ve diseksiyon sırasında 24 kuyu plakasını buzun üzerinde tutun.
Papain DNase I ayrışma karışımını makalede açıklandığı gibi hazırlayın. Şimdi büyütülmüş bir uç transfer pipeti ile retinaları alın. Retinalar ucun dibine yerleşene kadar bekleyin ve retinaları aşırı HBSS olmadan Papain DNaz I karışımını içeren tüpe bırakın.
Daha sonra, tüpü inkübatördeki bir nutatöre yerleştirin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksit ile 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, bir mililitrelik pipetle dikkatlice yukarı ve aşağı pipetle çekerek hücreleri ayırın. Hücreler ayrıştıktan sonra, Papain'i nötralize etmek ve yukarı ve aşağı pipetleyerek, hafifçe karıştırmak için Papain ayrışma kitinden 275 mikrolitre ovomukoid proteaz inhibitörü ekleyin.
Tüpleri bir santrifüje yerleştirin ve 300'lük göreceli bir merkezkaç kuvvetinde sekiz dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış hesaplanan büyüme ortamı hacmine epidermal büyüme faktörü ekleyin. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın.
Tüpün altındaki pelete dokunmadan, süpernatantı dikkatlice ve tamamen çıkarın. Şimdi hücre peletini 500 mikrolitre epidermal büyüme faktörü takviyeli büyüme ortamı ile yeniden askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunu etiketli 12 kuyucuk plakasının bir kuyucuğuna aktarın.
Tüpü, 500 mikrolitre epidermal büyüme faktörü takviyeli büyüme ortamı ile durulayın ve kuyuya ekleyin. Kuyu plakasını dikkatlice sallayın, ardından plakayı karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. %90 ila %100 hücre akıcılığını kontrol ederek başlayın.
Ardından, ortamı çıkarın ve kuyuyu yıkamak için bir mililitre soğuk HBSS ekleyin. Plakayı yavaşça sallayın ve HBSS'yi iz bırakmadan çıkarın. Daha sonra, hücreleri kuyudan ayırmak için önceden ısıtılmış tripsin içeren bir çözeltiden 500 mikrolitre ekleyin.
Yavaşça sallayın ve 37 santigrat derece inkübatörde iki dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı inkübatörden biyo güvenlik kabinine taşıdıktan sonra, eğerken tripsin içeren çözeltiyi aspire edin. Hücreler tamamen ayrılana kadar dikkatlice ve yavaşça kuyunun üzerine birkaç kez dağıtın.
Daha sonra, bu hücre süspansiyonunu steril bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve tüpleri santrifüje koyun. Dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 300 kez g'de döndürün ve tüpleri biyo güvenlik kabinine geri getirin. Pelet dokunmadan süpernatantı çıkarın.
Şimdi 600 mikrolitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek ve yaklaşık 30 ila 40 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücre peletini dikkatlice askıya alın. Son olarak, tohum 100 mikrolitre elde edilen hücre süspansiyonunun ortasındaki altı kaplamalı kapak 24 kuyu plakasının kapağıdır. Plakayı inkübatöre yerleştirin ve mikro RNA taklitlerini kullanarak hücrelerin sonraki transfeksiyona yerleşmesine izin verin.
Şekil, transfeksiyondan beş gün sonra birkaç Ascl1-Domates pozitif hücresi bulunan kontrol koşullarını göstermektedir. Bununla birlikte, bir miR-25 tedavisinden sonra, daha birçok Ascl1-Domates pozitif hücresi bulunur. Niceliklendirme, miR-25 ile tedavi edilen kuyulardaki Ascl1-Domates pozitif hücrelerinin sayısında, kontrollere kıyasla dört kat artış olduğunu ortaya koydu.
En önemlisi, riR-25 ile tedavi edilen kuyularda bulunan Ascl1-Domates pozitif hücrelerinin büyük çoğunluğu nöronal bir morfoloji benimsemiştir. Bu nöronal morfolojinin özellikleri arasında azalmış hücre soma boyutu, ince süreçlerin gelişimi ve küçük ağların oluşumu vardı. Niceliklendirme, tüm Ascl1-Domates pozitif hücrelerin yaklaşık% 70'inin nöronal özelliklere sahip olduğunu ortaya koydu.
İmmünofloresan etiketleme, nöronal morfolojiye sahip Ascl1-Domates pozitif hücrelerin, nöronal kimliği doğrulayan nöral belirteçler OTX2 ve MAP2'yi eksprese ettiğini göstermektedir. Bu hücrelerin nicelleştirilmesi, miR-25 aşırı ekspresyonundan sonra, kontrollerde alan başına beş nöronal hücreye kıyasla, alan başına yaklaşık 40 Ascl1-Domates pozitif nöronun mevcut olduğunu ortaya koymuştur. Tanımlanan nöronal hücreler, miR-25 ile tedavi edilen örneklerin toplam Ascl1-Domates pozitif hücre popülasyonunun yaklaşık% 70'ini oluşturur.
Ayrıca, OTX2 ve MAP2 birlikte eksprese eden nöronların mutlak sayısının nicelleştirilmesi, miR-25 tedavisinden sonra, kontrollerde alan başına 10 nörona kıyasla, alan başına yaklaşık 60 nöron bulunduğunu göstermiştir. Temiz ve steril aletlerle temiz ve sterilize edilmiş bir ortamda çalışmak ve her türlü sert muameleden kaçınarak dikkatli çalışmak zorunludur. Aşağı akış uygulamaları örneğin, protein miktarı, DNA veya RNA analizi veya elektrofizyolojik çalışmalar olabilir.
Bu teknik, rejeneratif tıp alanına ait nükleer yeniden programlama ile ilgili ilk soruları araştırmamıza yardımcı oldu. Ve yeni soruları keşfetmek için test edilebilecek çok çeşitli faktörler ve koşullar var.
