We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

Not: kullanarak uzak akciğer dokusundan Bu çalışmada, akciğer mezenkimal stromal hücreler (LR-MSC&#39;ler) için izole edilmiştir, ya da hücre yüzey markerlerinin ifadesiyle (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1, yüksek, EpCAM negatif) 14,15 göre eksplant dışı büyüme 16, ya da enzimatik sindirimi 17 kullanarak. Yapışık LR-MSC&#39;ler, yüksek glikoz ve hiçbir glutamin,% 15 FBS, 1 x antibiyotik / antimikotik ve 2 mM glutamin (bundan böyle komple ortamı) ile DMEM içerisinde kültürlendi ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edildi. LR-MSC&#39;ler, migrasyon deneyi ile nispeten homojen bir büyüme özelliklerine sahip bir hücre popülasyonu sağlamak için 3-4 kez geçirilmiştir. 1. konfluent tek tabaka hazırlanması <ol><li> Standart 100 mm kültür kaplarından MKH&#39;lerin ayırmak için, 37 ° C önceden ısıtılmış 10 ml PBS ile yıkama hücreleri PBS aspire ve tripsin 4 ml (% 0.25) ilave edin. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 3-5 dakika kuluçkalayın. C aspire5 dk hücreleri aşağı pelet için bir konik tüp içine arşın, 300 g tam medya ve santrifüj eşit miktarda ekleyin. Not: tripsin içinde uzun inkübasyon hücre yüzey reseptörleri değiştirebilir ve potansiyel geçiş etkileyebilir. </li><li> Medya aspire ve taze eksiksiz bir medya tekrar süspansiyon hücreleri. Hücreleri saymak tripan mavisi dışlanmasını kullanarak ölü hücreleri hariç ve 60 mm hücre kültürü çanak eksiksiz bir medya 4 ml 500.000 mezenkimal stromal hücreler plaka. Not: hücre kaynağına bağlı olarak, testler gereken hücre optimal sayısını belirlemek için gerekli olabilir. </li><li> Plakalar optimum hücre eki ve çoğalması için% 90 konfluent, MSC için genellikle 48-72 saat kadar inkübe hücreleri. Not:% 100 izdiham onların göç kapasitelerini değiştirebilir birçok ankraj bağımlı hücreleri deneyim temas inhibisyonu, çünkü, tavsiye edilmez. Görüntü analiz yazılımı boşluğu yorumlamak çünkü% 80&#39;den az izdiham ile Tabaklar kullanılamaz fotoğraflar neden olacaktırsıfırdan çevresinin bir parçası olarak hücreler arası s (Şekil 1D bakınız). </li><li> Hücreler% 90 izdiham ulaştınız sonra, uygulama için uygun olarak hücrelere zarar. Çözünür sigara dumanı ekstraktı (CSE) maruziyetten sonra hücre hasarı değerlendirmek için, 2 dakika 18 üzerinde bir Büchner şişesi içinde eksiksiz bir medya 25 ml ile 1 University of Kentucky araştırma sigara (3R4F) duman çizerek% 100 CSE üretir. </li><li> Tam ortam içinde seyreltilmiş 4 mi% 1-4 CSE 24 saat süre ile inkübe hücreleri. Kuluçkadan sonra, 4 ml yeni, tam ortam ile değiştirmeden önce, ılık steril PBS ile iki kez 4 ml yıkama hücreleri. Not: sigara dumanı özü yüksek konsantrasyonda (&gt;% 5) ile zarar görmesi hücreleri esas olarak izdiham azaltabilir. </li></ol> 2. Scratch oluşturma <ol><li> Steril bir ortamda, hasarlı MKH 60 mm plaka kapağı çıkarın ve AC (örneğin steril bir plastik cetvel için) bir cetvel yatıyorduross plakanın üst kenar. Ortamı çıkarmadan, yaklaşık 5 mm aralıklı plaka üzerinde bir ila dört paralel çizikler ve uzun 50 mm yapmak için steril düz kenar tarafından yönlendirilen bir steril 200 ul pipet ucu kullanın. Not: Bir düz kenar o mikroskop sahnede olduğunda plaka için gerekli dönme ayarlamalar miktarını en aza indirir. Bu çizikler ekranda tamamen dikey (veya yatay) görünür olması zorunludur. 60 mm plaka üzerinde birden fazla çizik oluşturma hücre göçü (veriler gösterilmemiştir) etkileyen bir şekilde mikro-değiştirmez, ancak diğer hücre tipleri için bir göz olabilir. Kuyunun kenarına yakın büyüyen hücrelerin değişkenliği daha belirgin hale gelir ve çizilmelere tekdüze nesil etkileyebilir çünkü küçük kuyuların kullanılması tavsiye edilmez. </li><li> Ortamı aspire ve yavaşça sıfırdan merkezine yapışan hücreler önlemek için önceden ısıtılmış tam ortam 2 ml plakaları yıkayın ve hücre kaldırmak içinkaşınma gevşetilmiş olan s. Taze tam ortam 4 ml ile değiştirin. </li><li> Steril kalıcı bir kalem kullanarak, çizikler görüntüleme engel olmaz yerde plakanın alt 1-4 her çizik etiket. Not: çizik genişliği varyasyon olabilir, çünkü aynı sıfırdan görüntüleri öncesi ve göç sonrası karşılaştırıldığında önemlidir. </li></ol> 3. Scratch başlangıç ​​Görüntüleri alarak Not: çizik deneyi birden plakalar üzerinde yapılırsa, bu çizikler sonraki plaka üzerinde yapılmadan önce tek bir plaka üzerinde tüm çizikler ilk görüntüleri alınması tavsiye edilir. <ol><li> Analiz için gerekli görüntüleri oluşturmak için bir kamera ile bir ters faz kontrast mikroskobu kullanın. </li><li> Mikroskop kültür plakası yerleştirin ve çizilmeye # bulmak için düşük güç hedefi (10X) kullanın 1. Kültür plaka kapağına yoğuşma net bir imag engelleyen isehücrelerin e 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılmış bir kademeli dizi kullanılır. </li><li> Gerekirse kadar görüntüler elde tamamen yatay ve görüş alanının merkezinde sıfırdan tutulması scratch uzunluğunun% 90 kapsayacak. Görüntüler arasında hiçbir örtüşme ile sıfırdan farklı bölümlerinin görüntüleri elde edebilir. Not: kültür çanak kenarlarında ışık kırılma analiz etmek, onları imkansız hale görüntüleri overexposes. Bu nedenle, ilk görüntüleri almak ve scratch uzunluğunun% 5 sürmez. </li><li> Ayrı bir klasörde her sıfırdan görüntüleri kaydedin. </li><li> Tekrarlama çizilmelere 2, 3 3,2-3,4 ve 4. adımları. </li><li> Hemen ilk görüntüleme sonra inkübatör plakaları dönün. Hücreler 4-7 saat göç edelim. Not: CSE ile hasarlı MKH&#39;lerin değerlendirirken 7 saat uygunudur. Hücre çoğalması, hücre göçü için karıştırıcı bir değişken olarak hareket edebilir, çünkü daha büyük 7 saat boyunca inkübe (aşağıda isteğe bağlı Not 8.2) tavsiye edilmez. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. İlk Scratch Görüntüleri Analiz <ol><li> (Malzeme / Ekipman Tablo bakınız) ImageJ indirin ve Yara İyileşmesi Aracı eklenti yüklemek. </li><li> ImageJ görüntü dosyasını açın, sonra Yara İyileşmesi Aracı çizik alanı (Şekil 2B) hesaplamak için sıfırdan çevreleyen hücrelerin vurgulamak için &quot;Kenarları Bul&#39;u&quot; &quot;Süreç&quot; linkine tıklayın ve. Sonra, &quot;Görüntü&quot;, &quot;ayarlama&quot; &quot;Renk Eşiği&quot; ve &quot;Eşik Renk&quot; etiketli açılır menüden değerini değiştirmek tıklayın &quot;B &amp; W.&quot; </li><li> Çizik ve hücre ön arasında optimum kontrast elde edilinceye kadar &quot;Renk Eşiği&quot; menüsü içinde, hem de parlaklık eşik sürgü ayarlayın. Görüntüdeki kontrast oluşturur sağa (tamamen siyah resim) tamamen alt kaydırıcıyı hareket ettirin ve sonra maksimum kontrast oluşturmak için üst kaydırıcıyı ayarlamak için çalışıyoruz büyük aralığı için izin vermek için. </li><li> Yavaş yavaş üst bri ayarlamakGörüntü temiz sıfırdan (Şekil 2C) konturu görüntüler kadar soldan sağa ghtness kaymak. Sıfırdan kenarları tespit edildikten sonra, çizik bölgeyi vurgulamak için, açılır menüden &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; seçeneğini seçin ve &quot;m&quot; düğmesine (o ImageJ araç çubuğunda görünecektir) basın ImageJ araç çubuğundaki &quot;Daha Araçlar&quot; tıklayın ve çıkış sonuçları pop-out pencere (Şekil 2B) bilgisayarlı alan. </li><li> Kopyala ve bir excel elektronik tabloya sonuç penceresinde (Şekil 2E) tüm sayıları yapıştırın. Bireysel çizilmelere verileri ayırmak için emin olun. </li></ol> 5. Scratch Final Görüntüleri alarak <ol><li> Hücreleri (4-7 saat) göç ettikten sonra, tekrar 3.2-3.4 yineleyin. Görüntü her tabakta hücreleri göç eşit zaman oldu, böylece çizik aynı sırayla plakalar. Not: Hücreler çoklu zaman noktalarında görüntülü olabilir, bunların sensi bağlı olarakHer iki sıcaklık ve pH değişikliklerine tivity. Alternatif olarak, canlı hücre görüntüleme onlar göç gerçek zamanlı olarak hücreleri izlemek için kullanılabilir. </li></ol> 6. Final Scratch Görüntüler incelendiğinde <ol><li> Tekrarlayın son çizik görüntüler için 4.2-4.5 adımları tekrarlayın. </li></ol> 7. Göç belirlememize Scratch Alanını Hesaplama <ol><li> İlgili çiziklerin ilk alan değerlerinin ortalaması alınarak ortalama öncesi göç alan hesaplayın. </li><li> Ortalama öncesi göç alanında (adım 7.1) den, 6. adımda hesaplanan her bir görüntü için son göç alan, çıkartılmasıyla göç toplam tutarı hesaplayın. Göç değişikliği temsil eden her sıfırdan değerlerinin bir listesini oluşturun. </li><li> (Yani hücreleri üzerinde tüm tabak ve tüm çizikler% 0 ÖAM&#39;ye maruz) aynı test grubunda birden fazla çizilmelere verileri Havuz. Deney grupları arasındaki farklılıkları analiz etmek için Varyans testi bir analizi kullanın. </li><li> Hücreler geçirmek yavaşsave (büyük 10-12 saat daha az) çizilmemesi sonra uzun bir kuluçka süresi gerektirir, hücreler göç tahlil meydana edildiği dönemde herhangi çoğalmasını geçiren olup olmadığını bir BrdU veya edu kuruluş tahlil 19 belirlemek için gerçekleştirin. Önemli hücre çoğalmasını önlemek için bir geçiş süresi tahlil seçin. </li></ol> İsteğe bağlı 8. <ol><li> Önemli hücre yaşlanması kazıma işleminin bir sonucu olarak meydana gelen olup olmadığını değerlendirmek için, 19 çizilmeye sonra önceden tespit edilmiş zamanlarda, bir test plakası üzerinde yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz deneyi yapar. </li></ol>

<ol>
	<li>Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative,+facile,+and+high-throughput+image-based+cell+migration+method+is+a+robust+alternative+to+the+scratch+assay.">A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).</li><li>Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).</li><li>Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+or+stromal+cells:+a+review+of+clinical+applications+and+manufacturing+practices.">Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices.</a> Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).</li><li>Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+alters+nuclear+shape+and+reduces+cell+motility+in+three+dimensional+model+substrates.">Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+Integrin+Regulates+Lamellipodia+Protrusion+Via+a+Focal+Complex/focal+Adhesion-Independent+Mechanism.">Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).</li><li>Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+wound+healing+effect+of+Calendula+extracts+using+the+scratch+assay+with+3T3+fibroblasts.">Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts.</a> J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing:+an+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays.">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).</li><li>Chung, C. A., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber.">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li><li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules.">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li><li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates.">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li><li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy.">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li><li>McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction.">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).</li><li>Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival,+Persistence,+Paracrine+Expression,+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung.">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li><li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aging+on+the+regenerative+properties+of+bone+marrow-,+muscle-,+and+adipose-derived+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells.</a> PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).</li><li>Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cigarette+smoke+extract+on+human+airway+smooth+muscle+cells+in+COPD.">Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD.</a> Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).</li><li>Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence:+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay.">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek ve çizilmeye deneyleri analiz etmek için kantitatif sağlam, standart bir yöntem sağlar. Basit çizik deneyleri rutin hücresel göç incelemek için çalışmanın çok farklı alanlarda kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel karalama tahlil tekrarlanabilir 7,10 ile ilgili sorunlar yol açmıştır standart bir set-up ve miktar protokolünü yoksun kalmıştır. Modifikasyonlar ve çizik testi geliştirilmesi için optimizasyonlar birçok bireysel canlı hücr...

Hücre göçü, doku gelişimi, onarım ve yenileme, hem de kanser metastazı ve damar sertliği 1 gibi patolojik işlemler gibi birçok fizyolojik süreçte yüksek oranda koordine ve hayati önem taşımaktadır. Hücre göçü bir anlayış hasarlı dokuları tamir ve hücre nakli teknolojileri ve yapay doku 2 aşılama dahil patolojik durumların tedavisinde kullanılan gelişmekte olan tedavilere özellikle önemlidir. , Doku tamirini 3 aracılık titizlikle, ölçülebilir uyarlanabilir ve uygun maliyetli ilgi olduğunu bir deney kullanılarak bu hücrelerin göç kapasitesinin miktarının mezenkimal stromal hücreler (MKH) rolü mevcut ilgi dikkate alındığında. Daha da önemlisi, bu tip bir analiz hücre hasarı sonrası göç kapasitesi nispeten küçük değişiklikleri tespit etmek için yeterince hassas olması gerekir. Çizik deneyleri, trans-kuyu göç deneyleri, hücre göçü miktarının da dahil olmak üzere mevcut metodlar (Boyden chamberleri), micropillar diziler ve hücre yasak bölge tahlilleri tekrarlanabilirlik, customizability, ölçümü ve maliyet etkinliği 1,4,5 sınırlamaları bir dizi sahiptir. Burada anlatılan optimize karalama tahlil sonuçlarını sağlam, ölçülebilir ve görüntü tabanlı analiz yetenekleri, maliyet-etkililik ve diğer uygulamalara uyum gösterir. Kazı deneyleri, farklı deney koşulları altında 5 hücresi yayılmasını ve çoğalmasını değerlendirmek için çok sayıda kapasitelerde kullanılmıştır. Deney veya yakınındaki izdiham tamamlamak için onlara büyüyen belirlenmiş tohum hücreleri ve steril bir iğne veya bir pipet ucu 6 ile elde edilen tek tabakalı çizilmeye gerektirir. Analiz en çok rastgele seçilmiş yerle 7-9 birden fazla zaman noktası boyunca sıfırdan genişliğini karşılaştırılmasıyla gerçekleştirilir. Onun belirgin kullanılmasına rağmen, çizilmeye tahlil tekrarlanabilirlik ve ölçümü ile ilgili sorunlar ile şaşırmış. Değişkenliğisıfırdan nesil değil, sadece hücrelerin mikro değiştirir, ama aynı zamanda plaka yüzeyi ve altında yatan hücre dışı matriks-5 zarar vererek hücre göçü engelleyebilir. Deneyler genellikle, ancak daha yavaş göç ve daha uzun deney süreleri gösteren hücre hatları için, 12 saat ila 7 üzerinden yürütülmektedir, proliferasyon, bir karıştırıcı bir değişken 7,10 olur. Son olarak, kaşıma işlemi tarafından oluşturulan yaşlanmış hücreler tek tabakalı 1 açığını kapatmak için gerekli dışı sinyalizasyon müdahale faktörleri serbest bırakabilirsiniz. Karalama tahlil Optimize tahlil süresi uzunluğu en aza indirerek, ve manipülasyon sırasında istenmeyen hücre ölümünü engelleyen, yüzey özelliklerine müdahale etmeyen tutarlı bir boşluk yaratılmasını gerektirir. Durdurucu bazlı analiz, bir hücre yasak bölge testinin bir optimizasyon olduğunu. Bu deney, hücre büyümesinin hariç oyuk ortasına yerleştirilen bir stoper kullanılmaktadır ancak bu hücreler, merkezi hariç bırakma bölgesi çevresindeki kaplama sağlar.Göç değerlendirmek için, durdurucu çıkarılmaktadır ve elde edilen dışlama alanı geçiş meydana gelmesi için bir yüzey sağlar. Bununla birlikte, bu deney, özelleştirmek veya 10 adapte zordur ve bazı uygulamalar için, bu teknik, aynı zamanda engelleyici mal olabilir. Sıfırdan deneyleri ve bunların türevleri, trans-çukurlu göç deneyleri (veya Boyden oda tahlilleri) aksine kemotaktik maddeler 8,11 ihtiva eden bir hazneye, mikro-gözenekli bir filtre zarı içinden bir odacıktan hareket hücre sayısının ölçülmesi ile göç değerlendirmek 12. Gözenekli zarından göç sonrasında, hücreler kemotaktik ajanlara maruz membran tarafına yapışır ve doğru ölçmek için zor olabilir, çünkü bu teknik, MSC gibi yapışık hücreler için programı sınırlıdır. Tahlil bazı üç boyutlu göç yollarını incelemek mümkün olsa da, kısıtlı hücre tipleri hangi için doğru hücre göçü limitini kendi yarar ölçmek mümkün 10. Karalama deneyleri için başka bir alternatif deforme ve bir vekil olarak diziye göç hücrelerinin yeteneği kullanarak üç boyutlu bir uzayda hücresel motilitesini ölçen bir mikro-ayağı dizisi kullanır. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerler kesin bir kalıp üzerine tedavi ve ozon ile tedavi ve fibronektin homojen olmayan parçalanabilir mikro üretir. Dizi 4 girmek için hücrelerinin yeteneği ölçmek için gerektiği gibi mikro-kolonu boşluk da değişebilir. Kalıp, yüksek boy oranı dizisinin 13 negatif bir sürümünü oluşturmak için silikon gofret derin reaktif iyon aşındırma yoluyla oluşturulur. Tahlil onun customizability tarafından güçlendirilmiştir edilirken, yetenek göç hücrelerinin doğrudan görselleştirme yoluyla üç boyutlu göç ve analiz modeli, mikro-ayağı diziler yaratmada güçlük ekonomik yaygın kullanımını engellemektedir. Bu protokol açıklanan optimize karalama tahlil verimli, cos sağlarserbestçe kullanılabilir yazılımı kullanılarak analiz edilebilir ve tutarlı bir şekilde çiziklerin üretilmesi için T-etkili bir yöntemdir. Bunun yerine önce ve hücre göçü sonrasında sıfırdan genelinde yapılan basit genişlik ölçümleri, yazılım öncesi ve sonrası toplam çizilmeye göç alanlarını belirlemek için kullanıcı sağlar. Bu gelişme nerede genişlik ölçümleri alınmalıdır çizik belirlemeye çalışıyor konusunu sınırlayan ve sıfırdan genişliği olsun o uzunluğu boyunca üniform olduğunu. Buna ek olarak, hücre sayıları, hücre izdiham tipi ve hücrelere verilen hasarı derecesi dikkatli optimizasyonu daha deneyi optimize etmek için ele alınmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Burada sunulan karalama deneyleri fare akciğer ikamet mezenkimal stromal hücreleri (LR-MKH&#39;lerin) kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve protokol notları başvurulan olarak izole edilmiştir. LR-erişkin 60 mm doku kültürü çanağı içinde 500.000 hücre yoğunluğunda tohumlanır ve 48 saat% 90 konflüansa büyütülmüştür. Hasar oluşturmak için,% 4 CSE (yukarıda tarif edilmiştir), ilk tohumlama dönemin ardından 24 saat süre ile, ancak sıfırdan analizden önce hücreler ile inkübe edildi. Her ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract at JoVE

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

optimization-wound-scratch-assay-to-detect-changes-murine-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.8K Görüntüleme.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Video: Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebra balığı Keratosit Eksplantlarındaki Deri Yara İyileşmesi Toplu Hücre Göç ve reepithelialization Eğitim için

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Gelişim Biyolojisi

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...