Bu yeni teknik, iyon hareketliliği-kütle spektrometrisini, üçlü bir kompleksin iki rakip ayrışma reaksiyonunun göreceli termokimyasını belirlemek için moleküler modelleme ve reaksiyon dinamiği teorisi ile birleştirir. Bu tekniklerin kombinasyonu, reaktanları ve ürünlerin reaksiyon yollarını, konformasyonel yapıları ve ligandın metal iyonu ile üçlü bir kompleks oluşturmak için afinitesini karakterize eder. Bu araştırma, rekombinant protein saflaştırması için iki potansiyel peptid etiketinin reaktivitesini modellemektedir; burada etiket, hareketsiz bir metal afinite sütununda nitrilotriasetik asit tarafından şelatlanmış metal ile reaksiyona girmektedir.
2 mililitrelik numuneyi 2,5 mililitrelik künt burun şırıngasına yükleyerek ve cihazın şırınga pompasını kullanarak numuneyi cihazın elektrospreyine dakikada 10 mikrolitre akış hızında enjekte ederek başlayın. Cihazı negatif iyon hareketliliği-kütle spektrometrisine veya IM-MS moduna yerleştirin. Kütle spektrometri programını açıp Spektrum'u seçerek, negatif yüklü alternatif metal bağlama üçlü kompleksinin veya amb-metal-NTA kompleksinin kütle-yük izotop modelini tanımlayın.
Ardından, Araçlar ve ardından İzotop Modeli'ni seçin. Açılır pencerede, kompleksin moleküler formülünü listeleyin, Yüklü İyonu Göster kutusunu işaretleyin, negatif olanın yükü için 1 girin ve kompleksin görüntülenen izotop desenini OK.In tıklayın, en düşük kütle zirvesini not edin. Cihaz yazılımında Kurulum'u ve ardından Dörtlü Profil'i seçin.
Ardından, Manuel Sabit'i seçin ve en düşük izotopik desen zirvesinin kütlesini girin. Güncelle'ye tıklayın ve pencereyi kapatın. Yine, Kurulum'u seçin ve ardından Dörtlüyü Çözme'ye tıklayın.
5 dakikalık çalışma süresi ve 2 saniyelik tarama süresi kullanarak ilk transfer çarpışma enerjisiyle başlayan negatif iyon IM-MS spektrumlarını toplayın. Diğer çarpışma enerjilerinin her biri için IM-MS spektrumlarını toplamak için tekrarlayın. Üçlü amb-metal-NTA kompleksi ve iki ürün, NTA-metal kompleksi ve amb-metal kompleksi için entegre varış zamanı dağılımlarını veya ATD alanlarını, göreceli bir yüzde ölçeğine normalleştirmek için kullanın.
Çoğaltma eşiği çarpışma kaynaklı ayrışma veya TCID ölçümlerinden, her veri noktasının ortalama ve standart sapmalarını bulun. Ardından, laboratuvar çerçevesi transfer çarpışma enerjisini kütle merkezi çarpışma enerjisine dönüştürün. Çarpışma kesitlerini ölçmek için, enstrümantal çalışma koşullarını kullanarak 10 ppm poli-DL-alanin veya PA numunesinin negatif iyon IM-MS spektrumlarını 10 dakika boyunca toplayın.
Ardından, her üçlü kompleksin IM-MS spektrumlarını 5 dakika boyunca toplayın. PA ve üçlü komplekslerin her birinin ATD'sini ayıklayın ve Sürüklenme Süresini Koru seçeneğini kullanarak dosyalarını kütle spektrometresi yazılımına aktarın. Ortalama varış sürelerini ilgili ATD eğrilerinin maksimumundan bulun.
Ortalama varış sürelerini üçlü kompleksin çarpışma kesitlerine dönüştürmek için kesitsel bir kalibrasyon yöntemi kullanın. CRUNCH ana menüsünden, ürünlerin kütle merkezinin enerjisini veya ECM'ye bağımlı göreceli yoğunluklarını içeren GB5 metin dosyasını açın. Parametreleri okumak için Hayır'ı yanıtlayın.
Ardından, Modelleme'yi ve ardından Tüm Parametreleri Ayarla'yı seçin. Reaksiyon modeli seçeneklerinden, varsayılan Eşik CID seçeneğini ve ardından üçlü kompleksin enerji transferi dağılımı üzerinden entegrasyon ile RRKM'yi seçin. Modellenen bağımsız ürün kanalları için 2 değerini girin ve Kesitleri hesapla'yı seçin.
Kıvrımsız modelin türü için, çarpışma hücresinden uçuş zamanı dedektörüne 50 mikrosaniyelik zaman penceresi nedeniyle kinetik kaymaların istatistiksel RRKM düzeltmesini içeren 0 Kelvin kesitini seçin. Evrişim seçenekleri için, üçlü kompleks iyon ve argon çarpışma gazı arasındaki translasyonel enerji dağılımları üzerindeki evrişimi içeren Tiernan'ın çift integralini seçin. Sayısal entegrasyon yöntemi için, önceden kaydedilmiş kesitleri olan Gauss Quadrature'u seçin.
Moleküler parametreleri girme seçeneklerinden, üçlü kompleksin PM6 titreşim ve dönme frekanslarıyla yapısal modelleme dosyasını okumak için G girin. Soruya Evet cevabı: Reaktanlardan biri atomik midir? Modelleme dosyasının konumunu ve adını yazın.
İyon üzerindeki yük için 1 ve argon gazının polarize edilebilirliği için 1.664 girin. İyon kütlesi ve hedef kütlesi sırasıyla üçlü kompleks ve argon içindir ve GB5 metin dosyasından otomatik olarak okunur. Harmonik titreşimler için 0 girin.
Yapısal modelleme dosyasından 1-B ve 2-B dönme sabitlerini okumak için Enter tuşuna basın. Engellenen rotor işlemleri için varsayılan 0 ve molekül simetrisi için 1 varsayılan değerlerini seçin. Reaktant sıcaklığı için varsayılan 300 Kelvin'i seçin.
Durum dizisinin yoğunluğunu azaltma yöntemi için Tümleştirme'yi seçin. Enerji dağılımını kesmek için Evet'i seçin. Dağıtım için maksimum enerji için 40000 dalga sayısı, bin boyutu için 2 dalga numarası ve enerji dağıtımındaki nokta sayısı için 32 dalga numarası girin.
TCID/RRKM modeline ilişkin parametreler için Değişiklik için Evet'i seçin, Sabit Süre için 0 değerini ve algılama penceresinin üst sınırı için 0,000050 saniye girin. Ürün kanalı 1 için, ayrıştırma kanalı seçeneklerinden tek bir geçiş durumu için 1'i ve sıralı ayrışmaların hiçbiri için 0'ı seçin. Geçiş durumu türü için, yörüngede 1'i seçin.
Amb-metal kompleksi ve NTA ürünleri için PM6 dönme ve titreşim parametrelerini içeren modelleme programı dosyalarını okumak için G'yi seçin. Hayır girin: Faz uzayı sınırı geçiş durumundan biri veya PSL TS, atomik türlerden biri mi? Amb-metal karmaşık dosyasının konumunu ve adını girin.
Ölçek frekansları için 1.062 kullanın, atom sayısı için Enter tuşuna basın ve Hayır girin: Molekül doğrusal mı? NTA ürününün titreşim ve dönme frekanslarını içeren modelleme dosyası için de aynısını tekrarlayın. Yörüngedeki TS'nin açıklamasını girin. Amb-metal iyonunun yüklenmesi için 1.0 girin ve ardından NTA'nın polarize edilebilirliğini ve dipol momentini girin.
Dönme sıcaklığı için 0 Kelvin ve yörüngedeki geçiş durumunun tedavisi için kilitli dipol seçin. Amb-metal iyonunun ve NTA'nın ortalama kütlelerini girin. Modelleme dosyalarından 1-B ve 2-B döndürme sabitlerini okumak için Enter tuşuna basın.
Engellenmiş rotorlar için 0, molekül simetrisi için 1 ve reaksiyon dejenerasisi için 1 seçin. Değişiklik Yok seçeneğine girin. Ürün kanalı 2 için, tek geçiş durumu için 1'i, sıralı ayrışma için hiçbiri için 0'ı ve geçiş durumu türü için yörünge için 1'i seçin.
NTA-metal kompleksi ve amb ürünleri için PM6 dönme ve titreşim parametrelerini içeren modelleme dosyalarında okumak için G'yi seçin. Ardından, yörüngedeki TS'nin açıklamasını girin. NTA-metal kompleks iyonunun yüklenmesi için 1.0 girin ve amb'nin polarize edilebilirliğini ve dipol momentini girin. Dönme sıcaklığı için 0 Kelvin'i ve yörüngedeki geçiş durumunun tedavisi için kilitli dipol'ü seçin.
NTA-metal kompleksi ve amb ürünlerinin ortalama kütlelerini girin. Modelleme dosyalarından 1-B ve 2-B döndürme sabitlerini okumak için Enter tuşuna basın. Engellenmiş rotorlar için 0, molekül simetrisi için 1 ve reaksiyon dejenerasisi için 1 seçin.
Ardından, Değişiklik Yok girin. Etkin olmayan 2-B rotasyonları işlemek için, istatistiksel açısal momentum dağılımı için varsayılan seçenekleri belirleyin ve P-E, G yerine J dağılımını entegre edin. Tümleştirmedeki nokta sayısında varsayılan 32 değerini kullanın.
Model menüsü için, Verileri Sığdırmak için Parametreleri En İyileştir'i seçin ve sırasıyla veri sığdırmaya başlamak ve bitirmek için minimum enerjiyi ve maksimum enerjiyi girin. Ağırlıklandırma modellerinin deneysel standart sapmaları için 1'i seçin. Verilere dayanarak, tipik olarak 0,01 ila 0,001 arasında kabul edilebilir minimum standart sapma seçin.
E0 yakınsama sınırı için varsayılan değeri kullanın ve herhangi bir parametreyi bugünkü değerde tutmak için Hayır'ı, alt ve üst sınırlar için 0,5 ve 2,0 elektronvoltu ve türev değerlendirme yöntemi için 2'yi seçin. Optimizasyon menüsünden, Optimizasyona Başla'yı seçin. CRUNCH programı, seçilen TCID modelini deneysel verilere göre optimize edecektir.
Son olarak, Model menüsünde, iki ayrışma kanalının termokimyasal değerlendirmesi için T'de delta-H ve S'yi seçin. Temsili görüntü, alternatif metal bağlayıcı A ve H peptitlerinin birincil yapılarını göstermektedir. Renk, potansiyel metal bağlama bölgelerini vurgular.
Amb-metal ve NTA-metal ürün iyonlarını oluşturmak için enerji bağımlılığı burada gösterilmiştir. Amb-metal-NTA üçlü kompleksinin% 50 ayrışmasının olduğu kütle merkezi çarpışma enerjisi, grafiklere dahil edilmiştir. Temsili görüntüler, enerji çözümlü TCID yöntemi için dinamik modeli göstermektedir.
AmbH-çinko-NTA kompleksi artı argon arasındaki çarpışmalar, ambH-çinko kompleksine ve serbest NTA'ya veya NTA-çinko kompleksine ve serbest ambH ürünlerine ayrışmaya neden olur. E1 ve E2 eşik enerjileri, sırasıyla ambH-çinko-NTA kompleksinin ambH-çinko kompleksine ve serbest NTA'ya veya ambH-çinko-NTA kompleksinin NTA-çinko kompleksine ve serbest ambH'ye reaksiyonları için ayrışmanın 0 Kelvin entalpine eşittir. A ve H'nin PM6 geometrisi optimize edilmiş üçlü amb-metal-NTA kompleksleri burada gösterilmiştir.
Bu uygunlaştırıcılar, deneysel verilerin TCID modellemesinde kullanılmış ve PM6 elektronik enerjileri ile hesaplanan çarpışma kesitlerinin IM-MS ile karşılaştırıldığında nasıl ölçüldüğü çarpışma kesitleri karşılaştırılarak diğer aday yapılardan seçilmiştir. Dört amb-metal-NTA kompleksinin enerji çözümlü TCID'si bu görüntülerde tasvir edilmiştir. A ve H Türleri için, kıvrımlı CRUNCH eşik uyumları ile amb-metal ve NTA-metal ürün iyonları burada gösterilmiştir.
Enerji değerleri, amb-metal-NTA'nın amb-metal'e ve serbest NTA'ya veya amb-metaL-NTA'nın NTA-metal'e ve serbest amb'ye reaksiyonları için 0 Kelvin'de ayrışma entalpileri vardır. Burada mol başına kilojoule cinsinden Gibbs serbest birleşme enerjilerinin ve ayrışma entalpileri olan net sıfır Kelvin'den türetilen oluşum sabitlerinin, PM6 parametrelerini kullanan statik mekanik hesaplamalarıyla karşılaştırılması gösterilmiştir. NTA-nikel ve serbest ambA'nın ambA-nikel-NTA kompleksini oluşturmak için reaksiyonu en yüksek oluşum sabitini sergiler ve ambA etiketli proteinin afinite sütunu içindeki NTA-nikel tarafından hareketsiz hale getirildiği reaksiyonu temsil eder.
CRUNCH montajı, doğru eşik enerjileri elde etmek için reaktanların ve ürünlerin dikkatli bir şekilde taranmasını gerektirir. Yapıları ve güvenilir moleküler parametreleri elde etmek için moleküler modellemede uzmanlık gereklidir. Burada açıklanan genel yöntemler, enzimatik fonksiyonları bloke etmek için metal kofaktörleri ve proteinlerin aktif bölgelerini bağlamak için tasarlanmış moleküllerin etkinliğini taramak için geliştirilebilir.
