Ekstrahepatik hbv viral replikasyon ekstrahepatik sendromların patogenezinde önemli rol oynar. Şu anda ekstrahepatik HBV enfeksiyonu başlatmak için hücre kültürü modelleri sınırlıdır. HBV replikasyonunu etkileyen yeni konak faktörlerinin belirlenmesine ve HBV'ye bağlı böbrek hastalıklarının araştırılmasına yardımcı olmak için in vitro hepatik olmayan bir enfeksiyon modeli saiyoruz.
Geleneksel HBV enfeksiyon modelleri ile karşılaştırıldığında, 293T hücre hattı, 293T-NE-3NR'yi benimsedik ve tasarladık ve HepG2.2.15 ile birlikte kültürlendik. HBV enfeksiyonu biyogüvenlik düzeyi iki veya biyogüvenlik düzeyi üç laboratuvarda yapılmalıdır. Laboratuvar personelinin güvenliğini sağlamak için laboratuvar güvenlik uygulamaları takip edilmeli ve tüm araştırmacılar HBV deneyleri yapmadan önce aşılı olmalı ve HBS antikor pozitifini saptamalıdır.
HepG2.2.15 hücrelerini, hücre süpernatantYanı sıra tüm ipuçları, şişeler, plakalar ve HepG2.2.15 ile temas tüpleri bertaraf edilmeden önce bir gecede% 2 virucide batırılmış gerektiğini akılda tutarak culturing başlayın. Sıvı nitrojen den HepG2.2.15 hücreleri içeren şişe çıkarın ve 37 derece santigrat su banyosunda nazik girdap içinde eritin. Hücreleri 25 santimetre karelik doku kültürü şişesine aktarın ve dört mililitre tam kültür ortamı ekleyin.
Kültür HepG2.2.15 hücreleri 37 santigrat derece ve 5% karbondioksit nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi. Ortamı her üç günde bir değiştirin. Hazır olduğunda, 50 mililitrelik bir santrifüj tüp hücre supernatant toplamak.
Kapağı sıkıca kapatın ve parafin film ile sarın. Hücre parçalarını çıkarmak için, Yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüp içine 0,45 mikrometre membran ile HepG2.2.15 supernatant filtre. Daha sonra bir virüs yoğunlaştırıcı sütuna 14 mililitre filtrelenmiş supernatant ekleyin ve kapağı kapatın.
Sütunu 3, 200 kez g'de yatay bir dönen santrifüjde 35 dakika bekleyin ve HepG2.2.15 supernatant konsantresini 1,5 mililitrelik bir tüpe toplayın. HepG2.2.15 supernatant konsantresindeki HBV DNA'sının standart eğri aralığında olması durumunda konsantrasyonun gerçek zamanlı PCR'yi çalıştırın. 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe 190 mikrolitre DMEM'e 10 mikrolitre ekleyerek konsantreyi 20 kat seyreltin.
Supernatant konsantresi ile birlikte, negatif bir kontrol, pozitif kontrol ve nicel referans dört seyreltme hazırlamak. Her numuneye 450 mikrolitre HBV DNA ekstraksiyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 12,000 kez g'de santrifüj edin. 27 mikrolitre PCR ana karışımını ve buz üzerine yerleştirilen PCR tüplerinde numune başına üç mikrolitre Taq polimeraz enzimini birleştirin.
Daha sonra her tüpe santrifüjlü numunenin 20 mikrolitresini ekleyin. El yazması talimatlara göre gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin ve standart bir eğri elde etmek için CT değerlerini dışa aktarın. HepG2.2.15 supernatant konsantresini aliquots'a bölün ve kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
El yazması talimatlara göre enfeksiyon ortamı hazırlayın. Sonra tohum HepG2-NE iki kuyuda, 293T-NE-3NR hücreleri iki kuyuda, ve 293T-NE bir kuyuda. Hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın ve nemlendirilmiş bir kuvözde %5 karbondioksit 24 saat boyunca.
Kuluçkadan sonra hücreleri gözlemleyin ve sağlıklılarsa enfeksiyona devam edin. Her kuyuya enfeksiyon kompleksinin 500 mikrolitresini ekleyin ve hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Hücreleri 500 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın.
Sonra her kuyuya bir mililitre orta ekleyin. Orta yı iki günde bir hafifçe değiştirin. 11. günde, hücreleri 500 mikrolitre PBS ile yavaşça yıkayın ve immünoresans için buz gibi metanol ile hücreleri düzeltin.
Tohum 100, Iki kuyu içine HepG-NE kuyu başına 000 hücreleri, iki kuyu içine 293T-NE-3NR, ve 293T-NE plaka bir kuyu içine. Tohum 100, 000 hücre hepG2.2.15 ayrı bir altı-iyi plaka beş membran ekler içine kuyu başına. Hücreleri 24 saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, hücrelerin tüm yapışık ve iyi durumda olduğundan emin olun. Altı kuyu plaka ve hücre zarı ekler orta atın. Daha sonra HepG2.2.15 ile membran kesici uçları HepG-NE, 293T-NE-3NR ve 293T-NE ile tohumlanmış altı kuyuplakasına yerleştirin.
Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın ve her üç ila dört günde bir ortamı değiştirin. 10 gün sonra, membran kesici uçlarını çıkarın, hücreleri pbs ile iki kez hafifçe yıkayın ve immünoresans için buz gibi metanol ile hücreleri düzeltin. HBcAg primer antikor ve DAPI ile kuluçka, floresan ters mikroskopta 10X hedefi ile gözlendiğinde belirgin bir boyama ile sonuçlandı.
Nükleer lokalizasyon DAPI ile boyama ile doğrulandı ve NTCP-EGFP ekspresyonu yeşil floresan ile tespit edildi. HBcAg'ın ekspresyonu kırmızı floresan ile tespit edilmiştir. DAPI, NTCP ve HBcAg aynı hücrede yken, hücre başarılı bir şekilde HBV ile enfekte olmuştur.
Siklosporin A grubu, HBV'nin NTCP'yi engelleyerek hücrelere girmesini engellediği için negatif kontrol oldu. HBcAg 293T-NE-3NR'lerde saptandı, ancak NTCP'nin 293T'deki HBV enfeksiyonu için gerekli olan tek faktör olmadığını gösteren 293T-NE hücrelerinde saptanmadı. İyi hücre durumu ve verimli çalışma başarılı enfeksiyon sonuçları almak için önemli noktalardır.
Enfeksiyon sonrası ortamın nazik çehresinin yıkanması ve değiştirilmesi de önemlidir. Alternatif olarak hepatom bazlı HepG2-NE hücreleri ile HBV enfeksiyon yöntemi bu yönteme göre daha yüksek enfeksiyon verimliliğine sahiptir ve anti-HBV ilaç taraması için uygundur. 293T-NE-3NR hbv enfeksiyonu modelleme bu hücrelerin hepatik olmayan arka plan nedeniyle geleneksel hücre modeli için yararlı bir iltifat olduğunu.
Bu yöntem, hepatik olmayan hücrelerde HBV enfeksiyonunun yanı sıra HBV karaciğeri için gerekli konak faktörlerinin araştırılmasını kolaylaştıracaktır.
