Bu protokol, paralel olarak 48 bakteri izolatı üzerindeki iki C.elegans suşunda C.elegans oksidatif termal stres direnci üzerinde etkisi olan bakterilerin nasıl taranacağını açıklamaktadır. Bu yaklaşım çok yönlü ve ölçeklenebilir. Sağlık ve hastalık mekanizmalarının incelenmesine uygulanabilir olan sağlığa karşı C.elegans üzerinde etkisi olan çoklu koşulların hızlı bir şekilde taranmasını sağlar.
Stres direncini sağlık için bir vekil olarak kullanan bu boru hattı, nematod mutant, knockdown, transgenik ve hastalık modelleri üzerinde ilaçların, antiemetik ve probiyotiklerin klinik öncesi taramasına kolayca uygulanabilir. Birçok koşulu paralel olarak test etme kapasitesi, ilgili karmaşık etkileşimlerin incelenmesini sağlar ve fizyolojik süreçlere hizmet eder. Bunlar arasında konakçı mikrop etkileşimleri, metabolik bozukluklar, stresle başa çıkma ve yaşlanma sayılabilir.
Boyunca kontaminasyonu önlemek çok önemlidir. Solucanların yiyeceklerinin tükenmesine izin vermeyin ve solucanlar gerekli aşamaya ulaşır ulaşmaz önemli adımları uygulayın. Her biri iki mililitre OP50 başlangıç kültürü ile dört adet bir litrelik şişe lizojen et suyu aşılayarak konsantre bir E.coli OP50 bakteri kültürünün hazırlanmasıyla başlayın.
Daha sonra şişeleri 37 santigrat derece ve 160 G'de altı saat boyunca sallanan bir inkübatöre yerleştirin, ardından bakterileri 15 dakika boyunca 3057 G ve 20 santigrat derecede peletleyin. Daha sonra, süpernatantı atın ve peletleri altı mililitre OP50 ortamı ile yeniden askıya alın. Konsantre kültürü steril 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.
Suş başına sekiz adet altı santimetre NGM plakasını, bir gecede plaka başına 37 santigrat derecede yetiştirilen 100 mikrolitre doymuş OP50 kültürü ile aşılayın. Daha sonra kullanmadan önce plakaları iki gün boyunca 20 santigrat derecede tutun. Daha sonra bir neşter kullanarak yakın zamanda aç kalmış bir NGM plakasından solucanlarla 0,5 santimetrelik kare bir agar parçasını kesin ve sekiz aşılanmış altı santimetrelik NGM plakasının her birine aktarın.
Bu plakaları üç gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, bir P1000 pipet kullanarak altı santimetrelik NGM plakalarına üç mililitreye kadar steril M dokuz tampon ekleyerek solucanları yeniden askıya alın ve solucan çözeltisini tek bir 15 mililitrelik konik tüpte gerinim başına sekiz plakanın hepsinden toplayın. Ardından, dört santigrat derecede iki dakika boyunca 142 kez G'de santrifüj yapın ve bir P5000 pipeti veya steril bir Pasteur pipeti veya ucu ile donatılmış bir su pompası kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın.
Daha sonra, solucan peletini yıkamak için 10 mililitre steril M dokuz tampon ekleyin. Daha sonra, süpernatantı çıkarın ve solucanları bir pipet kullanarak konsantre OP50 ile desteklenmiş 15 santimetrelik OP50 aşılanmış bir NGM plakasına aktarın. Her solucan suşunu 15 santimetre çapında bir NGM plakası üzerinde 15 santigrat derecede üç ila dört gün boyunca büyütün ve solucanları günde 0,5 mililitre konsantre OP50 ile yeniden besleyin.
Bir M dokuz tamponunu toplayıp yıkadıktan sonra, her solucan suş kültürünü daha fazla NGM plakasına aktarın ve popülasyonun% 95'i yerçekimi yetişkinleri olana kadar solucanları 20 santigrat derecede çoğaltın. Daha sonra standart yumurta hazırlama yöntemini izleyerek gravid yetişkin solucanları ağartın ve sonraki adımlarda tüm L larvalarının yumurtadan çıkmasına ve eşzamanlı olarak büyümesine izin vermek için yumurtaları 15 santigrat derecede 24 saat boyunca iki tohumsuz 15 santimetre NGM plakasına aktarın. İlk olarak, daha önce altı santimetrelik bir LB agar plakasında yetiştirilen tüm bakteri kütlesini toplayın ve bir mililitre M dokuz tamponu içeren etiketli 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra bakteri peletleri tamamen yeniden askıya alınana kadar mikrosantrifüj tüpünü vorteksleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 9.300 kez G'de döndürün ve 700 mikrolitre süpernatan çıkarın. Bakteriyel peleti tekrar vorteks yaparak tekrar askıya alın.
Bunu takiben, her bakteri süspansiyonunun 200 mikrolitresini boş steril 96 kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Bu plakadan, çok kanallı bir pipet kullanarak sekiz adet 96 kuyucuklu NGM agaroz plakasını 10 mikrolitre bakteri çözeltisi ile aşılayın ve kapak 24 saat boyunca 25 santigrat derecede açık olarak inkübe edin. Daha sonra, 96 kuyu süspansiyon plakasını temiz yapışkan tavan filmi ile kapatın ve beş güne kadar 15 santigrat derecede saklayın.
Başlamak için, plakalara bakarak senkronize bir solucan popülasyonunun gelişim aşamasını değerlendirin. Solucanların% 90'ından fazlası L dört aşamasına ulaştığında, solucanları 15 mililitrelik konik tüplerde 10 mililitreye kadar steril M dokuz çözeltisinde toplayın. Daha sonra, OP50 bakterilerinden kurtulmak için her yıkamanın arasına 10 mililitre taze steril M dokuz eklerken, dört santigrat derecede iki dakika boyunca 142 kez G'de döndürerek solucanları dört kez yoğun bir şekilde yıkayın.
Ardından süpernatanı çıkarın ve solucan peletini 10 mililitre M dokuzda tekrar askıya alın. 50 mikrolitre solucan çözeltisini, 950 mikrolitre M dokuz içeren 1,5 veya iki mililitrelik düşük yüzeyli bir bağlama tüpüne aktarın. Solucan çökelmesini önlemek için tüp içeriğini nazikçe karıştırdıktan sonra, üç ila dört ayrı 10 mikrolitrelik damlayı bir cam kızağa veya bir NGM plakasına aktarmak için ıslatılmış düşük bağlantılı bir pipet ucunu hızla kullanın.
16X büyütmede bir stereo mikroskop altında, solucan çözeltisindeki mikrolitre başına solucan sayısını belirlemek için solucan sayısını sayın ve sayıları üç ila dört damla arasında ortalama. Solucan konsantrasyonunu 15 mililitrelik konik tüpte mikrolitre başına 15 solucana ayarlayın. Daha sonra sekiz mikrolitre solucan çözeltisini, çok kanallı bir pipet veya tekrar pipet kullanarak sekiz 96 kuyucuklu NGM agaroz plakalarının her birine aktarın.
36 saat sonra, 96 kuyu plakasının her bir kuyucuğuna 30 mikrolitre M dokuz dağıtın. Ardından, solucanları düşük tutma uçları kullanarak ayarlanmış düzenlere göre 384 kuyu plakasına aktarın ve plaka okuyucularının doğru şekilde ayarlanmasını sağlayın. Daha sonra, 384 kuyu plakasını daha fazla M dokuz ile doldurun ve termal stres testi için 40 mikrolitre M dokuz ve TBHP kaynaklı oksidatif stres için altı mikrolitre TBHP'ye 34 mikrolitre M dokuz ekleyerek kuyu başına 60 mikrolitrelik bir son hacim hedeflenir.
Ardından, TBHP eklendikten sonraki iki dakika içinde tahlili başlatın. Daha sonra, plakaları şeffaf kapaklarıyla kapatın ve 384 kuyu plakasının kenarlarını maskeleme bandı ile kapatın, böylece bandın kapağın üzerinden veya plakanın altından geçmemesini sağlayın. Ardından plakayı plaka okuyucuya yerleştirin.
Bir zirvenin gürültüden önemli ölçüde farklı olmayacağı bir floresan değeri belirleyin ve floresan dalgalanmalarının yükselmeden önce sönümlendiği en erken zaman noktasını not edin. Ardından, eğri uydurma için kullanılacakları için minimum ve maksimum floresan değerlerinin düşmesi beklenen zaman noktalarını not edin. Daha sonra, floresan zirvelerinin genliklerinin kuyucuklar arasında önemli ölçüde değişip değişmediğini kontrol edin.
Makalede açıklandığı gibi formülü kullanarak daha fazla analiz yapmadan önce verileri normalleştirin. İlk olarak, GitHub'dan LFASS'ı indirin ve MATLAB'ı başlatın ve LFASS klasörüne gidin. Ardından, ekrandaki talimatları izleyerek komut penceresine fit klasörü yazın ve çalıştırın.
Sığdırma klasörüne yazdıktan sonra, Excel dosyasının Verilerim olarak bulunduğu veri klasörünüzün adını yazın. Ardından, geçerli protokoldeki ardışık ölçümler arasındaki zaman aralığı için iki tane girin ve gürültü eşiği değerini yazın. Ardından, sigmoid uyumunu sınırlamak için 0,94 yazarak üst tolerans eşiğini ve 0,06 yazarak alt tolerans eşiğini atayın.
Maksimum ve minimum değerleri bulmak için zaman aralıkları ayarlayın. Yakınsak uyumları görsel olarak incelemek için, istendiğinde takılı ve pürüzsüz eğrileri görüntülememek için evet için Y veya hayır için N yazın. Ardından, yeniden düzenlemeyi denemek için yeni, alt ve üst zaman sınırları sağlayın.
Yenilemeyi denemek isterseniz, iki yazın. Ancak yenilemeyi kabul etmek ve bir sonraki eğriye geçmek istiyorsanız, sıfır yazın. Gürültü olarak tanımlanan eğrilerin analiz edilip edilmeyeceğine veya kötü takılmış eğrilerin yeniden düzenlenmesine karar vermek için, onaylamak için Y tipi ve reddetmek için N tipi.
Kalan tüm eğriler için yeniden sığdırma denendikten veya reddedildikten sonra program sona erer. Sonuç dosyalarını sonuçlar klasöründen alın ve aşağı akış analizi için nokta XLSX olarak kaydedin. Bristol N'de MYB11 veya MYB115 bakteri izolatları veya E coli OP50 kontrol bakterileri ile beslenen iki yabani tip solucan üzerinde ısı ve oksidatif stres direnci testleri yapıldı.
36 saat sonra, yetişkin vahşi tip solucan popülasyonları 42 santigrat derece termal strese ve% 7 TBHP kaynaklı oksidatif strese maruz kaldı. Medyan ölüm süresi, termal stres testi için 40 ila 130 dakika arasında ve oksidatif stres testi için 90 ila 240 dakika arasında değişmiştir. Solucanların adım 2.5'te yetiştirildiğinden ve adım 2.1'in iki saate kadar sürebileceğinden emin olmak için, adım 4.6'da 96 kuyudan 284 kuyu plakasına solucanlar hazırlamak için bir plaka düzeni çizin.
Adımlar eklenebilir veya değiştirilebilir. Örneğin, konakçı genomu geniş RNA ekranları veya bakteriyel genetik taramalar, sırasıyla RNI klonları veya bakteriyel mutantlar için bağırsak bakteri izolatlarının ikame edilmesiyle gerçekleştirilebilir. Bu yüzden şu anda bu yaklaşımı yeni probiyotikleri tanımlamak ve enfeksiyonlar ve yaşlanma bağlamında konakçı mikro etkileşimlerinde yer alan gen düzenleyici ağları ortaya çıkarmak için kullanıyoruz.
