Bu protokol, kinaz moleküler boyut fosforilasyonunu doğrudan değerlendirerek KCC2 regülasyonunda yer alan mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olabilir, böylece fizyolojik fonksiyonlarına ve aktivitelerine ışık tutabilir. Bir protein ekspresyonu çok küçük olsa bile, ilgili moleküllerin karmaşık karışımlarından ilgilenen proteinler gibi molekülleri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. Bu teknik, karmaşık sistemlerin protein analizi ve anormal doku fonksiyonunun veya hastalığının altında yatan potansiyel mekanizmaların belirlenmesi için gerekli bir araçtır.
Prosedürleri gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Sunday Solomon Josiah olacak. 37 santigrat derece boncuk banyosundaki tüm reaktifleri önceden silahlandırarak ve kararlı bir şekilde transekte edilmiş sıçan KCC2b insan embriyonik böbrek 293 hücrelerini tamamen boncuk banyosunda çözerek başlayın. Daha sonra hücreleri kriyo şişe tüpünden beş mililitre taze ortam içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri üç ila beş dakika boyunca 1.200 G'de santrifüj edin.
Bir vakum pompasına sabitlenmiş bir aspiratör pipeti kullanarak süpernatantı aspire ettikten sonra, hücreleri 10 mililitre taze ortamda yeniden askıya alın. Süspansiyonu 10 santimetrelik bir çanak tabağa aktarın ve 37 santigrat derece sıcaklığa ve% 5 karbondioksite sahip bir inkübatörde 48 saat boyunca büyümesine izin verin. Hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında, eski medyayı aspire ederek ve iki mililitre PBS ile durulayarak bölün.
İki mililitre tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık bir ila iki dakika inkübe edin. Tripsinizli hücreleri, tam ortamın iki mililitresini kullanarak yıkayın. Yeni yemeklere dokuz mililitre taze medya ekleyin.
Sonra eski tabaktan yeni tabağa bir mililitre çözelti ekleyin. % 90'dan fazla akıcılık elde etmek için bölünmüş hücre kaplarını 48 saat boyunca inkübatöre aktarın. Lizis tamponunda hasat edilmeden önce hücreleri dimetil sülfoksit, sekiz mikromolar staurosporin veya 0.5 milimolar N-etilmaleimid ile 15 dakika boyunca tedavi edin.
Transekte kültür kabından ortamı aspire edin, kültür bulaşıklarını buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve kaba 1.0 mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Soğuk bir plastik hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kabın dibinden kazıdıktan sonra, hücre süspansiyonunu buz üzerine yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sürekli ajitasyon yapın.
Hücre lizatlarını soğuk bir santrifüjde santrifüj ettikten sonra, buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı önceden soğutulmuş taze bir tüpe toplayın ve peleti atın. Pipet 300 mikrolitre Protein G Sefaroz bir mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirin.
Daha sonra çözeltiyi iki dakika boyunca 500 G'de santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, 500 mikrolitre PBS ve vorteks kuyusu ekleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın ve adımı tekrarlayın.
Daha sonra, PBS ile 500 mikrolitreye kadar hacmi telafi etmeden önce, bir miligram anti-KCC2 treonin 906 ve anti-KCC2 treonin 1007 antikorlarını 200 mikrolitre Protein G Sefaroz boncuklarıyla karıştırın. Titreşimli bir platformda veya dönen tekerleğin üzerinde dört santigrat derecede iki saat sallandıktan sonra, PBS ile iki yıkamayı tekrarlayın. Hücre lizatları üzerinde protein niceliği yapın ve yıkanmış boncuklara hücre lizatının bir miligramını ekleyin ve dönmeden önce uçtan uca bir rotatörde inkübe edin.
Son peleti 100 mikrolitre LDS numune tamponunda yeniden askıya almadan önce 150 milimolar sodyum klorür içeren PBS ile üç yıkama, ardından 200 mikrolitre PBS ile üç yıkama yapın. Tüpleri bir rotor çalkalayıcıda oda sıcaklığında beş dakika çalkalayın. Onları bir ısıtma bloğunda inkübe edin ve jel yükleme için süpernatantı kullanmadan önce santrifüj edin.
Western Blot döküm aparatını monte edin ve jeli dökmek için taze hazırlanmış% 8 ayırıcı jel dökün, döküm camının üstünden yaklaşık iki santimetre alan bırakın. Kuruluma 200 mikrolitre mutlak izopropanol ekleyin ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında durmasına izin verin. İzopropanolü bir pipet kullanarak çıkarın ve jeli yaklaşık 200 mikrolitre damıtılmış su ile dikkatlice durulayın.
Döküm kurulumuna taze hazırlanmış% 6 istifleme jeli ekledikten sonra, kuyu tarağına yavaşça oturtun ve 30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra döküm jeli elektroforez tankına sabitleyin. Çalışan tamponu tanka döktükten sonra, ilk kuyucuğa beş mikrolitre moleküler ağırlık işaretleyicisi ve SDS-PAGE jelinin her bir kuyucuğuna eşit miktarda protein yükleyin.
Boş kuyucukları LDS ile doldurun ve jeli 120 voltta yaklaşık 90 ila 120 dakika çalıştırın. Nitroselüloz membranı% 20 metanol içeren transfer tamponu ile rehidre edin. Jeli ve membranı transfer tamponu ile durulayın ve bunları hazırlama yığınına yavaşça yayın.
Aktarılacak sandviçi şu sırayla düzenleyin:negatif elektrot, sandviç köpüğü, filtre kağıdı durulanmış SDS-PAGE jel, durulanmış nitroselüloz membran, filtre kağıdı, sandviç köpüğü, pozitif elektrot. İşiniz bittiğinde, monte edilmiş sandviçi transfer tankına istifleyin ve 90 dakika boyunca 90 voltta veya 360 dakika boyunca 30 voltta çalıştırın. Bir blokaj tamponu kullanarak kuru membranı oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin.
Membranları, oda sıcaklığında bir saat boyunca veya gece boyunca dört santigrat derecede bloke edici tamponda uygun primer antikor ve beta-aktin seyreltimleriyle inkübe edin. Ardından, her biri beş dakika boyunca üç TBST yıkaması yapın. Yıkanmış zarı, 60 dakika boyunca bloke edici bir tamponda seyreltilmiş ikincil bir antikor ile inkübe edin ve üç TBST yıkamasını tekrarlayın.
İşiniz bittiğinde, yıkanmış zarı görüntüleme panosuna yerleştirin. Sinyalleri geliştirmek için, görüntüleme kartını görüntüleme için görüntüleme sistemine aktarmadan önce, her bir gelişmiş kemilüminesans reaktifinin eşit hacimlerinde membran üzerinde karıştırılmasıyla hazırlanan çözeltiyi yayın. HEK293 hücrelerinin staurosporin ve N-etilmaleimide veya NEM ile tedavisi, SPAK hedef bölgelerinde, T-döngü kinaz alanında bulunan treonin 233'te ve endojen olarak eksprese edilen SPAK'ın S-döngü fosforilasyon bölgesi serin 373'ünde fosforilasyonun azalmasına neden olmuştur.
Staurosporin, HEK294 hücrelerinde serin 940'ın fosforilasyonunu azalttı ve KCC2b'yi istikrarlı bir şekilde ifade etti, ancak NEM fosforilasyonunu önemli ölçüde arttırdı. Ayrıca, staurosporin, treonin 505 bölgesinde fosforilasyonu azaltırken, NEM aynı bölgede fosforilasyonda hafif ama önemsiz bir artışa neden olmuştur. Her iki bileşiğin treonin 505 bölgesinde protein kinaz C ve serin 940 bölgesinde KCC2b'nin fosforilasyonu üzerindeki diferansiyel etkileri iyi ilişkilidir.
Temsili sonuç ayrıca, NEM'in toplam KCC2 miktarının ekspresyonunda önemli bir artışa neden olduğunu, oysa toplam NKCC1 ve SPAK'ın ekspresyonunun her iki bileşikle de tedavi edildiğinde önemli ölçüde değişmediğini göstermiştir. Ayrıca, iki bileşik treonin 233 ve serin 373 bölgelerinde SPAK'ın fosforilasyonunun azalmasına neden oldu ve bu, sırasıyla treonin 906/1007 ve treonin 203/207/212'nin kısaltılmış fosforilasyonu ile ilişkili ve endojen olarak eksprese edilen NKCC1 ile ilişkiliydi. Ek olarak, staurosporin ve NEM, sırasıyla serin 940 bölgesinde protein kinaz C'nin fosforilasyonunu azalttı ve arttırdı ve sırasıyla staurosporin ve NEM tedavisi üzerine treonin 505 bölgesinde protein kinaz C deltasının fosforilasyonundaki azalma ve artış ile ilişkili olan KCC2b'yi kararlı bir şekilde ifade etti.
Uygun olmayan bir primer veya sekonder antikor kullanılırsa, görüntüleme sırasında bant görülmeyecektir. Ayrıca, çok düşük bir antikor konsantrasyonu kullanıldığında sinyal görünmeyebilir. Teknik, proteinin kantitatif analizinde ilgili bir araçtır ve etkili bir erken tanı aracı olarak da dahil olmak üzere birçok bilimsel ve kaynak amacı için kullanılmasına izin vermiştir.
