İnsan yetişkin korteksinin organotipik kültürleri, şimdiye kadar, insan aşılanmış ve insan konakçı hücreleri arasındaki etkileşimi incelemeye izin veren hasarlı korteks için kök hücre tedavilerini test etmek için tek sistemdir. Hayvan modellerinde test edilen bir terapi, kemirgen ve insan hücreleri arasındaki farklılıklar nedeniyle klinik ortamlara çevrildiğinde genellikle başarısız olur. Burada, aşılanmış hücreleri, hayatta kalmayı, farklılaşmayı ve işlevselliği insandan insana bir ortamda inceleyebiliriz.
Bu metodoloji, nöral devrenin insan beyninde nasıl çalıştığını anlamamıza yardımcı olacak ve ayrıca beyin hasarından sonra fonksiyonel iyileşmeyi iyileştirmek için bu bilginin klinik ortamlara çevrilmesini teşvik edecektir. Prosedürü gösteren, doktora öğrencisi Raquel Martinez-Curiel ve her ikisi de laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olan Costanza Aretio-Medina olacak. Başlamak için, kültür eklerini havalandırmalı bir başlığın altındaki hücre kültürü laboratuvarında forseps kullanarak altı delikli bir plakaya yerleştirin.
Membranla temas edene kadar kesici ucun altına beş mililitre insan yetişkin kortikal ortam ekleyin. Kabarcık oluşumundan kaçının ve kesici ucun üstüne iki mililitre ortam ekleyin. Doku dilimlerini eklere aktarmadan önce, inkübatörde en az iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte dengeleyin.
Dokuyu ameliyathanedeki hastadan dondurulmuş, kabarcıklı ve ezilmiş bir kesme çözeltisi kabına toplayın. Kapalı kabı buz üzerinde hemen laboratuvarın kesme alanına aktarın. Dokuyu inceleyin ve kortikal tabakanın yönünü göz önünde bulundurarak, vibratomun kesme aşamasına yapıştırmak için en iyi yüzeyi bulun.
Gerekirse, optimum dilim oryantasyonu için dokuyu sahneye yerleştirmek için düz olmayan yüzeyi neşterle kesin. Ardından, dokuyu doku yapıştırıcısı ile sahneye yapıştırın. Dilimleme odasına yerleştirin ve hemen soğuk, kabarcıklı kesme çözeltisi ile doldurun.
Tüm kesme prosedürü boyunca köpürmeye devam edin. Şimdi makalede açıklandığı gibi dokudan bıçağa yönelime bağlı olarak koronal veya sagital dilimleri kesin. Dilimleri oda sıcaklığında köpüren kesme çözeltisi ile toplama odasına yerleştirin.
Tüm doku kesildikten sonra, dilimlerden fazla sakkarozu çıkarmak ve hücre kültürü laboratuvarına taşımak için dilimleri oda sıcaklığında durulama çözeltisi ile steril bir Petri kabına aktarın. Daha sonra, doku dilimlerini ıslak ve batık eklerin üzerine ayrı ayrı yerleştirin. 24 saat sonra, kalan sakkaroz veya diğer artık maddeleri kesme prosedüründen çıkarmak için ortamı değiştirin.
İki hafta sonra, gentamisinsiz insan yetişkin kortikal ortamı kullanın. Medyayı hücre kültürü şişesinden çıkarın. Farklılaşmanın yedinci gününde, kortikal olarak astarlanmış GFP-lt-NES hücrelerini 500 mikrolitre tripsin ekleyerek ayırın ve oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, tripsin inhibitörünün eşit bir hacmini ve ardından beş mililitre DDM ortamı ekleyin. Hücreleri yeniden askıya alın, hücre süspansiyonunu nazikçe 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 300 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapınBu arada, insan dokusunu içeren plakayı inkübatörden kaputa aktarın ve kesici ucun üstünden iki mililitre ortam çıkarın. Santrifüjlemenin sonunda, süpernatanı çıkarın, hücreleri soğuk, saf, bazal membran matrisinde yeniden askıya alın ve emekli aylığını daha küçük bir tüpe aktarın.
Hücre süspansiyonunu, emme için kauçuk bir meme ucuna bağlı soğuk bir cam kılcal damara toplayın. Yarı kuru doku dilimini çeşitli bölgelere bıçaklayarak hücre süspansiyonunu küçük damlalar halinde enjekte edin. Jelin 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede katılaşmasına izin verin.
Daha sonra, plakayı inkübatörden tekrar davlumbaza aktarın ve dokuyu tamamen suya batırmak için kesici ucun üstüne dikkatlice iki mililitre insan yetişkin kortikal ortam ekleyin. Akut insan yetişkin kortikal dokusu, dokunun optimal korunmasını gösteren nöronların, oligodendrositlerin ve astrositlerin varlığını gösterdi. Doku, iki haftalık hücre kültüründen sonra nöronal belirteçler NeuN ve Map2'nin ekspresyonunu gösterdi.
Tüm hücre yaması kelepçe kaydı, nöronların akut preparatlardan gelen nöronlarla karşılaştırılabilir şekilde, dinlenme zarı potansiyelini ve membran giriş direncini sürdürdüğünü gösterdi. Hücreler taze dokudan biraz daha az aktifti, ancak hücrelerin çoğu çoklu aksiyon potansiyeli olmasa da en az birini ateşleyebildi. Akut kortikal doku, mikroglial belirteçler Iba1 ve Tmem119'un ekspresyonunu gösterdi.
Kültürde iki hafta sonra, mikroglia daha az ramifiye oldu ve akut dokudan daha aktif bir morfoloji kazandı. Ex vivo transplantasyondan dört hafta sonra, aşılanmış GFP-lt-NES hücreleri, tüm organotipik kültür boyunca geniş ve karmaşık arborizasyonlara sahip genişletilmiş nöritler sergiledi. Neredeyse hiç aşılanmış hücre kötü korunmuş dokuda hayatta kaldı.
Enkaz ve antikorların ölü hücreler üzerindeki spesifik olmayan etiketlemesi, insan dilimi boyunca geniş çapta gözlendi. Başarılı bir transplantasyon durumunda, hücreler fonksiyonel olarak aktif hale geldi ve olgun nöronlar tekrarlayan ve sıklıkla spontan aksiyon potansiyelleri gösterdi. Hızlı içe doğru sodyum, yavaş dışa doğru potasyum akımları ve belirli bir sinaptik aktivite seviyesi, greftin aşılamadan dört hafta sonra konakçı doku ile fonksiyonel entegrasyonunu gösterir.
İnsan dokusu ameliyathaneden çıktıktan sonra ne kadar hızlı işlenirse, sistemin yaşayabilirliği ve deneysel prosedürün başarısı o kadar yüksek olur.
