Bu protokol, fibröz plak dokusunun hem kollajen mimarisinin hem de mekanik arıza özelliklerinin lokal olarak değerlendirilmesini sağlar. Aynı doku örneği üzerinde hem yapısal hem de mekanik değerlendirmeler yapıldığından, bu teknik dokunun yapısal ve mekanik değerlendirmeleri arasındaki fonksiyonel bağlantının çözülmesine izin verir. Bu protokol ile fibröz plak dokusu yapısı ve başarısızlık özellikleri hakkında elde edilen bilgiler, aterosklerotik plak rüptürünün tetiklediği klinik ölümcül olayları önlemek ve tahmin etmek için anahtardır.
Başlamak için, cerrahi makas ve cımbız kullanarak plağı arterin uzunlamasına ekseni boyunca açın. Plak örneklerinden dikdörtgen test numunelerini kesin, numunelerin mümkün olduğunca büyük olmasını sağlayın ve gözyaşı veya kireçlenme içeren doku bölgelerinden kaçının. Daha sonra, bir plak testi örneği alın ve dokudaki iğneleri sabitleyerek her iki ucunu da silikona sabitleyin.
İğneler, mekanik test sırasında çekme test cihazının kelepçelerinde olacak numunenin bölgesine yerleştirin. Güvenlik gözlükleri takın. İğneleri kısaltmak için bir yan kesici kullanın, böylece mikroskop hedefine zarar vermelerini önlemek için numune yüzeyinin birkaç milimetreden daha az üzerine yapışırlar.
Petri kabını, numune suya batırılana kadar PBS ile doldurun. Ardından, mikroskop sistemini açın, çoklu foton anahtarını çevirin ve mikroskobun işletim yazılımını açın. Test örneğini içeren Petri kabını hedefin altına koyun ve mikroskop hedefini düşürün.
Canlı tarama modunu açın. Akıllı paneldeki düğmeleri kullanarak hedefi numunenin bir köşesine taşıyın ve Kutucuk Tarama panelindeki işaret konumu sembolünü tıklatın. Doğru şekilde gerçekleştirilirse, görüntüleme için seçilen tüm kutucukları içeren bir ızgara turuncu renkte görünür.
Ardından, örnek geometrisine genel bir bakış elde etmek üzere tüm numune yüzeyinin karo taramasını oluşturmak için ekranın sağ alt köşesindeki Başlat'ı tıklatın. Kutucuk taramasından sonra, otomatik olarak gösterilen Kutucuk Tarama panelinde sol üst kutucuğun sol üst köşesinin X ve Y koordinatlarını gözlemleyin. Bu koordinatları bir e-tabloda not edin.
Kutucuk Taraması panelinde, ScanField adlı kutucuktaki X ve Y yönlerindeki kutucuk sayısını gözlemleyin. E-tablodaki kutucuk taramasının boyutuna dikkat edin. Kutucuğun boyutunu ekleyerek veya çıkararak diğer kutucukların koordinatlarını hesaplayın.
Kutucuk taramasından, ikinci bir harmonik nesil veya SHG görüntüleme ile görüntülenecek kutucukları seçin. Seçim için, kelepçelerdeki fayanslardan kaçının ve seçilen her karo arasında hem uzunlamasına hem de çevresel yönde bir karo bırakın. Ardından, bu elektronik tablodaki hesaplanan koordinatları kullanarak görüntülenecek kutucukların konumunu belirleyin.
Belirlenen kutulardaki koordinatları doldurun ve hedefin sağ kutucuğa taşınması için Enter tuşuna basın. Canlı tarama modunu açın. Önemli ölçüde ağartma olmadan mümkün olan en yüksek lazer gücünü elde etmek için üst paneldeki kaydırıcıyı ve ışın yolu ayarlarını kullanarak çoklu foton veya MP lazer gücünü artırın.
Ardından, akıllı paneldeki düğmeyi kullanarak veya dedektörün adına, ışın yolu ayarlarına ve ek kanallara tıklayarak doygun pikseller olmadan parlak görüntüler elde etmek için dedektör kazancını ayarlayın. Dedektör kazancı için tipik değerler 500 ila 800 volt arasındadır. Netleme düzlemini ayarlamak için akıllı paneldeki Z konumu düğmesini kullanın.
Ardından, numunenin en üstüne gidin ve üçüncü panelden Edinme sekmesinin altındaki Z-yığını panelindeki ok ucuna tıklayarak Z yığınının üst kısmının konumlarını ayarlayın. Ardından, SHG sinyali artık algılanmayana kadar numuneye odaklanın. Yine, bu konumu ayarlamak için Z-yığını panelindeki ok ucuna tıklayın.
İşiniz bittiğinde, canlı tarama modunu kapatın. İkinci paneldeki Edinme sekmesi altında, açılır listeleri kullanarak tarama hızını 400 hertz'de tutun, satır ortalamasını ikiye ve çözünürlüğü görüntü başına 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Çift yönlü X tarama düğmesini açın.
Z-yığını panelinde z-adım boyutuna tıklayın ve kutuya üç mikronluk bir z-adım boyutunu doldurun. Bir Z-yığını oluşturmak için ekranın sağ alt köşesindeki Başlat'ı tıklayın. İşiniz bittiğinde, kutucuğun koordinatlarını dosya adına kaydedin veya her kutucuğa numarasını verin.
Görüntülemeden sonra, numune mekanik testlere tabi tutulur. Bir paketleme deseni oluşturmak için, doku boyasıyla doldurulmuş airbrush'ı test numunesinden yaklaşık 30 santimetre uzakta tutun ve lümenal yüzeye püskürtün. Daha sonra, tek eksenli çekme testi için, numuneyi, numunenin çevresel yönü çekme germe yönü ve numunenin lümenal tarafı yukarı bakacak şekilde çekme test cihazının kelepçelerine yerleştirin.
İlk ölçer uzunluğunun, şeridin genişlik-uzunluk oranı birden az olacak şekilde ayarlandığından emin olun. Tork tornavidası kullanarak 20 santimetrelik bir tork uygulayarak çenelerin vidalarını sıkın. Numune suya batırılana kadar PBS'yi ısıtma banyosuna ekleyin.
Yük hücresini yırtın ve yük hücresinden ve çekme test cihazının aktüatöründen global kuvvet ve yer değiştirme ölçümlerini kaydetmeye başlayın. Numunedeki gevşeklikten kurtulmak için 0,05 newtonluk bir ön germe uygulayarak numuneyi düzeltin. Ön germe uygulamasından sonra aktüatör tarafından yapılan gösterge uzunluğu ölçümüne bağlı olarak, %10'a kadar gerinim olmak üzere 10 döngü ön koşullandırma gerçekleştirin.
Yüksek hızlı kamera ile numune deformasyonunun bir videosunu kaydederken numunenin tamamen arızalanmasına kadar tek eksenli çekme testini başlatın. Arızadan sonra, küresel kuvvet ve yer değiştirme ölçümlerini kaydetmeyi bırakın. Çoklu foton mikroskobu veya MPM sırasında elde edilen Z-yığınlarını Görüntü J'de SHG ile açın ve her Z-yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonlarını veya MIP'lerini oluşturun.
Fayanslarda bulunan tek tek kollajen liflerinin oryantasyon açısını ölçmek için her MIP'yi açık kaynaklı MATLAB tabanlı fiber oryantasyon analiz aracıyla analiz edin. Açı dağılımı histogramına Gauss dağılımını sığdırmak için başka bir MATLAB tabanlı araç olan FibLab'ı kullanın. Gauss dağılım grafiğinden, dağılımın modu olan baskın fiber açısı, fiber açı dağılımının standart sapması ve anizotropik fraksiyon gibi yapısal parametreleri çıkarın.
Kopma başlatmanın gerçekleştiği çerçeveyi tanımlamak için kamera görüntüleri üzerinde görsel inceleme yapın. Kopma yerini görsel olarak tanımlayın. Çekme testi sırasında kaydedilen kamera görüntülerini kullanarak MATLAB tabanlı yazılım ncorr ile dijital görüntü korelasyonu, DIC analizini gerçekleştirin.
Referans görüntü olarak hataya kadar son germeden önceki son kareyi seçin. Geçerli görüntüler için, son esnemenin başlangıcından kopma başlatmanın gerçekleştiği çerçeveden önceki son kareye kadar ll görüntülerini seçin. Örnek yüzeyini ilgilenilen bölge veya yatırım getirisi olarak seçin.
Kelepçelerin yakınında bulunan alanları hariç tutun. Parametrenin alt küme yarıçapını 30 piksele, alt küme aralığını üç piksele, yineleme kesimini 50'ye, fark vektörü kesme normunu 10'a beş gücüne, gerinim yarıçapını beşe ve otomatik yayılma adımını beşe ayarlayarak DIC gerçekleştirin. Ncorr ile DIC analizinden, ROI'nin Green-LaGrange veya Eulerian gerinim dağılımlarını elde edin.
Bu gerinim dağılımlarını, yırtılmadan önceki son karede tüm plak numune yüzeyinin ortalama Green-LaGrange gerinimini hesaplamak için kullanın. Kopma yerindeki Green-LaGrange gerinimini hesaplayın. Test örneğindeki doğal yer işaretlerini kullanarak, karo taramasındaki kopma konumunu belirlemek için referans görüntünün ve karo taramasının bir bindirmesini yapın.
Kopmanın gerçekleştiği MPM-SHG kutucuğunu tanımlayın. Kopma, MPM-SHG ile taranan bir karoda değilse, kopma konumuna en yakın döşemeyi tanımlayın. Kopmanın meydana geldiği karoda bulunan yapısal parametreleri elde edin.
Burada çok az gözyaşı ve makrokalsifikasyon olan veya hiç olmayan taze ve sağlam bir plak örneği gösterilmektedir. Plak örnekleri bu gözyaşı ve kalsifikasyonları içermeyen bölgelerden alınabilir. SHG görüntüleme ve görüntü son işleme, görüntülenen her kutucuktan MIP'ler sağlar.
Lif algılama ile daha fazla son işlem, kollajen yapısal parametrelerinin çıkarılabileceği lif oryantasyon histogramları verir. Ayrıca görsel analiz için plak örneğinin tamamında lokal yapısal kollajen parametrelerini gösteren renk haritaları elde edilir. Bu test örneklerinden, yapısal kollajen parametrelerinde büyük bir örneklem içi varyasyon gözlenmiştir.
Çekme testi sırasında bir plak doku örneğinde rüptür başlangıcı ve yayılımı burada gösterilmiştir. Dijital görüntü korelasyon analizi, Green-LaGrange gerinim haritaları gibi yerel doku deformasyon haritaları sağlar. Bu suş haritalarından, lokal suşlarda büyük bir örneklem içi varyasyon gözlenmiştir.
Kamera kayıtlarında kopma yeri belirlendikten sonra, referans kamera görüntüsüne ve mikroskopi karo taramasına geri eşlenebilir. Bu, kopmanın gerçekleştiği MPM-SHG karosunu ve bu karoda bulunan yapısal parametreleri sağlar. Kalsifikasyon içermeyen ve mekanik test için işlenebilecek kadar büyük boyutta fibröz doku örnekleri elde etmek, ağır kalsifiye plaklar için zorlu bir görev olabilir.
Fibröz plak dokusu yetmezliğinin belirleyicisi olarak mekanik veya yapısal bir özellik tanımlandıktan sonra, bu özelliği ölçen bir in vivo görüntüleme sistemi, hastalarda plak rüptürü riskinin tahmin edilmesini sağlayacaktır.
