Этот протокол позволяет локально оценивать как архитектуру коллагена, так и характеристики механических повреждений ткани фиброзной бляшки. Поскольку как структурные, так и механические оценки проводились на одном и том же образце ткани, этот метод позволяет разгадать функциональную связь между структурными и механическими оценками ткани. Знания, полученные с помощью этого протокола о структуре ткани фиброзной бляшки и характеристиках недостаточности, являются ключом к предотвращению и прогнозированию клинических фатальных событий, вызванных разрывом атеросклеротической бляшки.
Для начала разрежьте бляшку вдоль продольной оси артерии с помощью хирургических ножниц и пинцета. Вырежьте прямоугольные тестовые образцы из образцов бляшек, убедившись, что образцы как можно больше, избегая при этом областей ткани, содержащих разрывы или кальцификаты. Затем возьмите тестовый образец зубного налета и закрепите оба его конца на силиконе, приколов иглы в ткани.
Вставьте иглы в область образца, которая будет находиться в зажимах устройства для испытания на растяжение во время механического испытания. Наденьте защитные очки. Используйте боковой резак, чтобы укоротить иглы, чтобы они торчали менее чем на несколько миллиметров над поверхностью образца, чтобы они не повредили объектив микроскопа.
Наполните чашку Петри PBS до тех пор, пока образец не будет погружен в воду. Затем включите систему микроскопа, поверните многофотонную клавишу и откройте операционное программное обеспечение микроскопа. Поместите чашку Петри, содержащую испытуемый образец, под объектив и опустите объектив микроскопа.
Включите режим сканирования в реальном времени. Переместите объектив в угол образца с помощью ручек на смарт-панели и щелкните символ положения метки на панели «Точечное сканирование». Если все сделано правильно, сетка со всеми выбранными плитками для изображения будет отображаться оранжевым цветом.
Затем нажмите кнопку «Пуск» в правом нижнем углу экрана, чтобы создать мозаичное сканирование всей поверхности образца и получить обзор геометрии образца. После сканирования плитки обратите внимание на координаты X и Y в верхнем левом углу верхней левой плитки на панели «Сканирование листов», отображаемой автоматически. Запишите эти координаты в электронную таблицу.
На панели «Сканирование плиток» обратите внимание на количество плиток в направлениях X и Y в поле ScanField. Обратите внимание на размер развертки плитки в электронной таблице. Вычислите координаты других плиток, сложив или вычтя размер плитки.
В развертке плиток выберите плитки для визуализации с помощью второй генерации гармоник или изображения ГСП. Для выбора избегайте плиток в зажимах и оставляйте по одной плитке между каждой выбранной плиткой как в продольном, так и в окружном направлении. Затем определите расположение плиток для изображения, используя вычисленные координаты в этой электронной таблице.
Введите координаты в соответствующие поля и нажмите Enter, чтобы цель переместилась на правую плитку. Включите режим сканирования в реальном времени. Увеличьте мощность многофотонного или мегапиксельного лазера с помощью ползунка на верхней панели и настроек траектории луча, чтобы получить максимально возможную мощность лазера без значительного обесцвечивания.
Затем отрегулируйте усиление детектора для получения ярких изображений без насыщенных пикселей с помощью ручки на смарт-панели или нажав на название детектора и настройки траектории луча и дополнительных каналов. Типичные значения коэффициента усиления детектора составляют от 500 до 800 вольт. Используйте ручку Z-позиционирования на интеллектуальной панели, чтобы отрегулировать плоскость фокусировки.
Затем перейдите в верхнюю часть образца и установите положение верхней части Z-стека, щелкнув стрелку на панели Z-стека на вкладке «Приобретение» на третьей панели. Затем сосредоточьтесь на образце до тех пор, пока сигнал ГСП не перестанет обнаруживаться. Снова нажмите на наконечник стрелки на панели Z-stack, чтобы установить это положение.
Когда закончите, выключите режим сканирования в реальном времени. На вкладке «Захват» на второй панели поддерживайте скорость сканирования на уровне 400 Гц, установите среднее значение строки равным двум, а разрешение — 512 на 512 пикселей на изображение с помощью раскрывающихся списков. Включите кнопку двунаправленного сканирования X.
Нажмите на размер z-шага на панели Z-стека и заполните z-шаг размером три микрона в поле. Нажмите «Пуск» в правом нижнем углу экрана, чтобы создать Z-стек. Когда закончите, сохраните координаты плитки в имени файла или присвойте каждой плитке свой номер.
После визуализации образец подвергается механическим испытаниям. Чтобы создать шпаклевочный рисунок, держите аэрограф, заполненный тканевым красителем, примерно в 30 сантиметрах от исследуемого образца и распылите его на просветную поверхность. Затем для одноосного испытания на растяжение поместите образец в зажимы тестера на растяжение так, чтобы окружное направление образца совпало с направлением растяжения при растяжении и просветной стороной образца, обращенной вверх.
Убедитесь, что начальная длина калибра установлена таким образом, чтобы отношение ширины к длине полосы было меньше единицы. Затяните винты захватов, приложив крутящий момент в 20 сантиньютон-метров с помощью динамометрической отвертки. Добавляйте PBS в нагревательную ванну до тех пор, пока образец не будет погружен в воду.
Разорвите тензодатчик и начните записывать глобальные измерения силы и смещения с тензодатчика и привода тестера на растяжение. Выпрямите образец, применив предварительное растяжение 0,05 ньютона, чтобы избавиться от провисания образца. Выполните 10 циклов предварительного кондиционирования с деформацией до 10% на основе измерения длины датчика приводом после применения предварительного растяжения.
Начните одноосное испытание на растяжение до полного выхода образца из строя во время записи видео деформации образца с помощью высокоскоростной камеры. После отказа прекратите регистрацию глобальных измерений силы и перемещения. Откройте Z-стеки, полученные во время многофотонной микроскопии, или MPM, с помощью SHG на изображении J и создайте проекции максимальной интенсивности или MIP каждого Z-стека.
Проанализируйте каждый MIP с помощью инструмента анализа ориентации волокон на основе MATLAB с открытым исходным кодом, чтобы измерить угол ориентации отдельных коллагеновых волокон, присутствующих в плитках. Используйте другой инструмент на основе MATLAB, FibLab, чтобы подогнать распределение Гаусса к гистограмме углового распределения. Из графика распределения Гаусса извлеките структурные параметры, такие как преобладающий угол волокна, который является модой распределения, стандартное отклонение распределения угла волокна и анизотропная фракция.
Проведите визуальный осмотр изображений с камеры, чтобы определить кадр, в котором происходит начало разрыва. Визуально определите место разрыва. Выполните анализ корреляции цифровых изображений, DIC, с помощью программного обеспечения на основе MATLAB ncorr, используя изображения с камеры, записанные во время испытания на растяжение.
Выберите последний кадр перед окончательным растяжением до сбоя в качестве эталонного изображения. Для текущих изображений выберите ll изображений от начала окончательного растяжения до последнего кадра перед кадром, в котором произошло начало разрыва. Выберите поверхность образца в качестве области интереса или рентабельности инвестиций.
Исключите участки, которые находятся рядом с зажимами. Выполните DIC, установив радиус подмножества параметра равным 30 пикселям, интервал между подмножествами — три пикселя, отсечку итерации — 50, норму отсечки разностного вектора — 10 в степени пяти, радиус деформации — пять и шаг автоматического распространения — пять. Из анализа ДВС-синдрома с помощью ncorr получите распределение штаммов Грина-Лагранжа или Эйлера ROI.
Используйте эти распределения деформаций, чтобы рассчитать среднюю деформацию Грина-Лагранжа всей поверхности образца бляшки на последнем кадре перед разрывом. Рассчитайте деформацию Грина-Лагранжа в месте разрыва. Используя естественные ориентиры в тестовом образце, сделайте наложение эталонного изображения и развертки плитки, чтобы определить место разрыва на развертке плитки.
Определите плитку MPM-SHG, где произошел разрыв. Если разрыв находится не в плитке, отсканированной с помощью MPM-SHG, определите плитку, ближайшую к месту разрыва. Получите структурные параметры, найденные на плитке, где произошел разрыв.
Здесь показан свежий и неповрежденный образец зубного налета практически без разрывов и макрокальцификаций. Образцы бляшек могут быть извлечены из областей, которые не включают эти разрывы и кальцификаты. Визуализация SHG и постобработка изображений обеспечивают MIP от каждой изображенной плитки.
Дальнейшая последующая обработка с помощью обнаружения волокон дает гистограммы ориентации волокон, из которых могут быть извлечены структурные параметры коллагена. Кроме того, для визуального анализа получаются цветовые карты, показывающие локальные структурные параметры коллагена по всему образцу бляшки. Из этих тестовых образцов наблюдалось большое внутриобразное изменение структурных параметров коллагена.
Здесь демонстрируется инициация разрыва и распространение в образце ткани бляшки во время испытания на растяжение. Корреляционный анализ цифровых изображений позволяет получить карты локальной деформации тканей, такие как карты деформаций Грина-Лагранжа. На этих картах штаммов наблюдалась большая внутривыборочная вариация местных штаммов.
После того, как место разрыва определено на записях камеры, его можно сопоставить с эталонным изображением камеры и сканированием плитки микроскопии. Это дает плитку MPM-SHG, где произошел разрыв, и структурные параметры, обнаруженные на этой плитке. Получение образцов волокнистой ткани, свободных от кальцификации и достаточно большого размера, пригодных для механических испытаний, может быть сложной задачей для сильно кальцинированных бляшек.
После того, как механическая или структурная особенность идентифицирована как предиктор недостаточности ткани фиброзной бляшки, система визуализации in vivo, измеряющая эту особенность, позволит прогнозировать риск разрыва бляшки у пациентов.
